从菜鸟到高手-手把手教你qPCR 教程II - 北京信诺金达生物科技有限公司.PDF

信诺金达-专业服务！ 从菜鸟到高手-手把手教你qPCR 教程 II 定量PCR 原理、常见问题分析和数据统计分析 前言 由于Real-time qPCR 的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研 究文章中涉及RT-PCR 的实验，也基本上被real-time qPCR 所代替。由于real-time aPCR 输出的数 据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR 的研究者常常感到高深莫测，不知 从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处 分析感到迷惑，不知所措。本文就从 real-time qPCR 的发展史说起，包括real-time qPCR 的原 ，实验设计，实际操作 （以ABI StepOne 仪器，和北京百泰克生物技术有限公司的试剂为例），数据分析，常见问题解答五个方面，手把 手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！ 一、Real-time qPCR 发展史 Real-time qPCR 就是在PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于 在 PCR 扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依 据。由于常规的PCR 的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展 非常迅速。设在已经涉及到生命 学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP 检测，等 位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。 在Real-time qPCR 技术的发展过程中，定量PCR 仪的发展起了至关重要的作用。1995 年， 美国PE 公司（已经并入Invitrogen 公司）成功研制了Taqman 技术，1996 年推出了首台荧光定 量 PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct 值进行数据分析。从而荧光定量 PCR 获得广泛应用。现在的定量PCR 仪有A BI 7000、7300、7500 ，7700、7900HT、StepOnePlus TM 、 StepOne TM 、PRISM StepOne TM 系列；BIO-RAD 的CFX96、iCycler iQ5 、MyiQ 、MJ Research Chromo4 TM TM Opticon 系列；Stratagene Mx 系列；Roche LightCycler 系列；Eppendorf Masercycler ；Corbett TM Rotor-Gene ；Cepheid SmartCycler 和BIOER 的LineGene 系列以及国内的一些品牌比如西安天 隆科技公司的TL 系列仪器。 二、Real-time qPCR 概述 1. Real-time qPCR 原 实时PCR 就是在PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。一般来讲， 定量 PCR 仪包括：实时荧光定量 PCR 仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测 光学系统、微 路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统 基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制 冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光 路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED ；荧光检测元件常用两种方式： 电话：010传真：010 E-mail: info@ 信诺金达-专业服务！ 光 倍增管和冷光CCD 摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时 PCR 扩增过程中，荧光信 号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和Ct 值。 2. Real-time qPCR 的数学原 也就是说为什么Ct 值跟初始模板的量成正比？首先来看一个real-time qPCR 中的重要 参数 （具体的后面会讲到）Ct 值 （Ct value），阈值 （thre