石油烃降解菌对环己烷及环己酮降解作用的研究 - 生态环境学报.docVIP

石油烃降解菌对环己烷及环己酮的降解作用 陈莉，苏莹，陈赢男，刘兆普*，郑青松 南京农业大学江苏省海洋生物学重点实验室，江苏 南京210095 原油中的环烷烃难以被微生物利用，能长期存在被污染的环境中，对环境造成严重持久的污染。针对环烷烃的污染问题，就微生物降解环己烷，环己酮的特性进行了研究。从胜利油田石油污染土壤中分离到1株能够分别以环己烷、环己酮为唯一碳源的降解菌A-1，经形态及生理生化特征和16 SrDNA的全序列测序分析，初步鉴定为节杆菌属（Arthrobacter sp.）。通过摇瓶试验得出其最适生长条件为温度35 ℃，pH 7.0。当盐质量浓度在10~20 g·L-1，环己烷体积分数在0.15 ~0.35 μL·mL-1，环己酮体积分数在0.20~0.30 μL·mL-1时，菌株A-1处于最佳生长状态。通过GC-MS分析，菌株A-1还能利用原油中C36~C39的链烃，此外还能降解丙酮，辛烷，甲苯等链烃和芳烃。菌株A-1的生长条件和比较宽的底物利用范围的这一研究，为其更广泛的污染环境的生物修复提供了理论依据。 降解菌；环己烷；环己酮；降解特性中图分类号：X1 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（200）0-0944-06没有取代基的环烷烃是原油的主要成分，其分子难以受到微生物攻击而被降解，能长期存在被污染的环境中，对环境造成持久严重的污染。由于环烷烃含量越高，油品的黏度越大，因此含环烷烃较多的原油更宜附着在土壤，地表水和海洋等环境中，使原油污染区域的生态更难以恢复。在环烷烃的微生物降解研究中，一般以环己烷作为难降解的代表性底物。根据目前研究表明[1]：环己烷分解代谢可能经历了环己醇，环己酮，e-己酸类脂，羟基羧酸4个过程。 自然界中几乎没有以环烷烃为唯一碳源生长的微生物，环烷烃的自然降解一般是通过微生物群落的共代谢完成的[2]。但现今已有报道通过实验室水平筛选、分离，得到了一些能够以环烷烃为唯一碳源的微生物。1919年Tausz和Peter[3]首次报道分离出一株能够利用环己烷的液化杆菌；1948年Imelik[4]报道分离出一株能利用环己烷并将其代谢成环己醇，环己酮，己二酸，甲酸和戊酸的铜绿假单胞菌。目前，国外对环烷烃微生物降解的研究，已经深入到降解代谢过程及相关酶类和这些酶的编码基因[5-7]。但我国的研究更多集中在对原油中链烃和多环芳烃的研究上。最新的报道，2007年鲁雅梅[8] 分离到两株对正烷烃有显著降解作用的降解菌。在环烷烃微生物降解方面的研究报道很少，到目前为止，只有1999年李大平[9]分离到一株能以环己烷，环戊酮为唯一碳源的降解菌株。本实验室从胜利油田受污染的土壤中分离到一株降解菌A -1，它对原油有明显的降解作用，并且能在以环己烷和环己酮分别为唯一碳源的培养基中生长。因此本文对筛选得到的菌株A-1进行了生理生化和分子鉴定，并对其最适生长条件，底物特异性及降解菌作用后原油成分变化等进行了研究，为菌株A-1在受环烷烃污染环境中的生物修复的应用奠定了基础。 原油(crude oil)由山东东营市胜利油田提供；环己烷（Cyclohexane，纯度大于99.5%）购自上海久意化学试剂有限公司；环己酮（Cyclohexanone，纯度大于99.5%）购自南京宁试化学试剂有限公司；石油醚（Petroleum ether；沸程30~60 ℃）购自北京益利精细化学品有限公司。 （1）细菌富集培养基[9]：（NH4）2SO4 5.0 g，葡萄糖2 g，KCl 1.1 g，K2HPO4·3H2O 1.5 g，NaCl 1.1 g KH2PO4 1.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母膏0.15 g，蒸馏水1 L，微量元素液5 mL，pH为7.0~7.5，经0.45 μL滤器过滤除菌的原油0.5%。其中微量元素溶液配方（w/ %）：ZnSO4 0.029 ，CaCl2 0.024，CuSO4 0.025，MgSO4 0.017，FeSO4 0.028。 （2）分离培养基: 为细菌富集培养基中除去葡萄糖，酵母膏后加入质量分数为2%的琼脂粉。 （3）环烷烃液体培养基[9]: KH2PO4 1.5 g ，(NH4)2SO4 1.0 g ，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，蒸馏水1 L微量元素液体积分数0.01%, pH 7.0~7.2。经0.45 μL滤器过滤除菌的环己烷及环己酮0.1%，其中微量元素溶液配方（w/ ‰）：ZnSO4· 7H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.5，CaCl2 0.3，MnSO4·H2O 0.06。无机盐固体培养基为液体培养基中加入质量分数为2%琼脂粉。 称取10 g土样（胜利油田原油污染土样）加入到9