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选修1 生物技术实践知识点 第一部分 微生物的利用 一、教学要求（实验目的）： 基本要求 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。 进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。 利用专一的培养基（含有尿素）分离专一的细菌（有脲酶的细菌）。 利用指示剂颜色的变化检知酶（脲酶）所催化的反应。 发展要求 说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。 说明 实验3不作要求。 二、知识要点： （一）实验1：大肠杆菌的培养和分离 1．本实验内容：将大肠杆菌扩大培养和划线分离。本实验用LB液体培养基扩大培养大肠杆 菌，再在LB固体培养基上划线分离。 本实验步骤：包括培养基配制、灭菌、接种、扩大培养、划线分离、保存菌种等几步。 2．培养基：细菌扩大培养要用LB液体培养基（含有蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、水等物质），划线分离要用LB固体培养基（常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存）。“细菌喜荤，霉菌喜素”，通常细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定的氯化钠，以维持一定的渗透压；霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。尽管培养基的配方各不相同，但其基本成分都一样（碳源、氮源、生长因子、水、无机盐等五类）。配制过程是：称量、溶化、调PH、分装等几步。 3．灭菌、消毒：培养微生物时，必须进行无菌操作。其首要条件是各种器皿必须是无菌的， 通常用高压蒸汽灭菌法灭菌，烘干后在超净台上还要打开紫外灯和过滤风灭菌；各种培养基也 必须是无菌的，转移培养基、倒平板、接种、平板划线、平板稀释涂布等操作中的每一步都 要做到无菌（防止杂菌污染）。 写出下列材料或器皿的灭菌、消毒方法： 培养基： 尿素： 接种环： 三角瓶： 超净台： 手： 问题1：如何确定培养基是否彻底灭菌？ 灭菌的培养基37℃恒温培养箱培养（培养皿倒置培养）12-24h，观察是否形成菌落。 4．菌种分离：细菌的分离方法有两种：划线分离法和涂布分离法。是消除污染杂菌的通用 方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。划线分离就是用接种环蘸菌液后在含 有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线的过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线最后，可使细菌间的距离加大。看到划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。将接种后的固体培养基培养10～20小时后，一个细菌细胞就会繁殖成许多细菌细胞，形成一个单菌落，不会重叠。在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是有一个细菌产生的后代。用于基因工程的大肠杆菌的工程菌，可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有抗性基因（如抗氨苄青霉素基因），如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素，由于非工程菌的其他杂菌都没有抗性基因，所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。 涂布分离时，需要先将培养的菌液稀释，通常稀释到10-5～10-7之间，然后取0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿中有20个以内的单菌落为最合适。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。 划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂。 问题2：细菌培养时为什么要将培养皿倒置？ 进行恒温培养时，要将培养皿倒置，是因为培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，若不倒放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。 （二）实验2：分离以尿素为氮源的微生物 尿素培养基唯一的氮源是尿素，属于选择培养基。脲酶能催化尿素分解为氨气和二氧化碳，氨 气呈碱性能使尿素培养基中的酚红变色。 第二部分 酶的应用 一、教学要求： 基本要求 得出制作果汁的最佳条件。 检测果胶酶的活性，观察果胶酶对果汁形成的作用。 制作固定化α—淀粉酶。 进行淀粉水解的测定。 发展要求 收集果胶酶在其他方面利用。 通过此实验探讨固定化酶的应用价值。 说明 实验5不作要求 二、知识要点： （一）实验4：果汁中的果胶和果胶酶 1．果胶是植物细胞壁的主要成分，也是植物汁液中的主要成分，由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成。山楂（山里红）的果实中果胶含量最多。果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，是很好的凝固剂，可结合大量的水分，降低植物组织的分散性，去掉果胶，就会使植物组织变得松散。果胶不溶于乙醇，这是鉴别果胶的一种简易方法。果胶酶和果胶甲酯