张宏杰论文开题报告.docVIP

上海应用技术学院 香料香精技术与工程学院 本科毕业论文（设计）开题报告 题目 绿色荧光蛋白GFP细胞表面展示体系的构建 专 业 __ 生物工程_ 学生姓名 ___ 张 宏 杰___ 学 号 __ 0910831231 班 级 ___ 指导教师 李 茜 茜 职 称 __ 讲 师 绿色荧光蛋白GFP细胞表面展示体系的构建 1 本课题国内外研究现状概述 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP2008年10月8日，美籍日裔科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁·沙尔菲（Martin Chalfie）和美国华裔科学家钱永健（Roger Y.Tsien）三人更是因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年的诺贝尔化学奖,极大地推动了绿色荧光蛋白在各领域中的应用。1962年，Shimomura等[2]在对多管水母发光蛋白的研究过程中，称另发现一种在日光下略显绿色，在白织灯下略显黄色，在紫外线下发出强烈的绿色荧光的蛋白，并随后研究了其发光特性。然而Shimomura本人对GFP的应用前景并不感兴趣，直到1988年，沙菲尔在得知GFP之后，大胆的将GFP技术应用到他所在研究的关于C.elegans的研究中去，从此开启了GFP在生物示踪领域的应用。在此后的研究中，沙菲尔发现GFP在植物细胞中的表现频率并不高，由此便萌生了对GFP进行改进的想法[3]。随着生物工程理论与技术的快速发展，GFP的应用领域也在逐步向外拓展，美籍华裔科学家钱永健进一步改进了GFP基因,使得不同的GFP产生的荧光颜色覆盖了整个可见光光谱，同时他改善了生色基团，增强了GFP的荧光特性，也提高了稳定性[3]。至此，绿色荧光蛋白GFP的应用已基本成型与完善。 1.1 绿色荧光蛋白GFP在各领域中的应用 绿色荧光蛋白GFP是一种存在于水母、珊瑚和水螅等腔肠动物体内，在日光下略显绿色，在白织灯下略显黄色，在紫外线照射下发出强烈的绿色荧光的生物发光蛋白。由于GFP分子量约27×103，是一个由238个氨基酸残基组成的单肽多链。为了确定GFP中的哪个部分与荧光特性有关，Dopf等[4]构建了GFP N-末端和C-末端部分缺失的表达载体，通过表达和检测发现，GFP 2-232个氨基酸对维持发光特性是必需的。呈酸性球状，发射光谱在505nm具有吸收峰，激光光谱在395nm和470nm处有吸收高峰。本身是一种形状类似水桶状的圆柱形蛋白，发光基团位于圆筒结构的中心部位。 1.1.1 在生物技术中的应用 1.1.1.1 分子标记 绿色荧光蛋白GFP因其具有稳定的荧光和构建载体方便等性质而常被用来做为标记物。生物界普遍利用GFP重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，随后在荧光显微镜下进行观察。通过测定融合基因中GFP的荧光强度来检测该基因的表达水平。同时，为了了解某一蛋白中蛋白质分子的迁移、定位、构象变化以及分子间的相互作用，通常将GFP分子作为标签融合到主体蛋白中，通过观察荧光标记来了解主体蛋白分子。 因其优异的生物学特性，绿色荧光蛋白GFP终将成为分子标记领域的新宠儿，随着生物理论与技术的不断完善，其应用前景也必将得到进一步的拓展。李倩等[5]就在其题为以CotX为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示绿色荧光的研究中运用了GFP作为分子标记的功能。 1.1.1.2 生物传感器 基于蛋白质工程技术开始通过将一个具有信号传导功能分子识别位点的分子结合到另一个分子上来设计生物传感器。首先绿色荧光蛋白GFP具有独特的光信号传导机制，其次，GFP在表达后易被周围环境和蛋白质间的相互作用所影响，因此极其适合用作活细胞体内的光学传感器[1]。 1.1.2 在信号转导中的应用 新研究发现，某些突变GFP能够发生荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRETFRET是一种从荧光分子的激发状态到临近基态接受分子之间量子力学能量转移现象。荧光接受分子必须在荧光提供分子释放态所具有的波长范围内接受能量，才能致使荧光共振能量转移FRET发生。 1.1.3 在筛选方面的应用 1.1.3.1 用于细胞筛选 由于GFP具有稳定的荧光能力和快速方便的检测方法，使其在细胞筛选上得到了广泛的应用。Yuk等[7]使用绿色荧光蛋白GFP作为生物标记能快速筛选出在生长抑制环境下，仍能保持重组蛋白大量表达的CHO细胞。 1.1.3.2 用于药物筛选 将目的物用GFP进行标记，在荧光设备下对其进行追踪，分析该目的物在细胞中的变化情况，如生物活性、离子通道、受体和酶分子分布状况等变化，筛选出与体内信号