dnd 基因簇对.DOC

论文中英文摘要 作者姓名：王连荣 论文题目： dnd 基因簇对细菌 DNA 骨架的磷硫酰化硫修饰 中 文 摘 要 本研究致力于探索 DNA 硫修饰的发生方式，解析这种 “前所未见” 的生理修饰的精细化学结构，也为后续 DNA 硫修饰生物途径、生物学意义等研究提供方向性指导。本学位论文成功地揭示了细菌中 dnd 基因簇可以将硫原子整合到 DNA 的磷酸骨架上, 形成序列特异性、空间构象专一性的磷硫酰化修饰揭示这种特异的生理修饰存在于不同的细菌中,DNA降解表型 DNA降解表型 (DNA degradation，Dnd) 最初是从变铅青链霉菌中观察到的电泳过程中，变铅青链霉菌的染色体不再是清晰的 DNA 条带，而是呈现降解状态。进一步研究发现，这是由于 DNA 上发生了一种异常的复制后修饰，导致 DNA 在电泳过程中容易遭受阳极产生的 Tris 过酸衍生物位点特异性攻击而产生双链切割反应。最近，研究者发现，这种异常修饰实际上是与 dnd 基因簇相关的 DNA 硫修饰。通过放射性 35S 喂养，在具有 dnd 同源基因簇/Dnd 表型的变铅青链霉菌 66，阿维链霉菌 NRRL8165 和荧光假单胞菌 Pf0-1 的 DNA上检测到放射性硫信号，揭示出除了碳、氢、氧、氮和磷，DNA 上还存在第六种元素硫。 本研究通过 35S 半胱氨酸喂养具有 dnd 同源基因簇/Dnd 表型的大肠杆菌，放射性硫标记的基因组 DNA。随后，把基因组 DNA 酶解成单脱氧核苷并利用高压液相色谱分离，结合液体闪烁计数器对每分钟分离组分的放射性强度检测，从而对硫修饰 DNA 分子的保留时间进行了精确定位，由此展开了对这种 “的硫修饰 DNA 化学结构的探索。 基于硫修饰 DNA 分子在高压液相色谱中的位置，继而采用高压液相色谱-质谱联用技术对其组分进行分析，发现了一组可能来自硫修饰 DNA 分子特征性质谱信号 597，446，348，152 和 136。是特征性的带有一个正电荷的鸟嘌呤碱基 (G) 的核质比；136 则是特征性的带有一个正电荷的腺嘌呤碱基 (A) 的核质比结合这组核质比信号以及该分子对核酸酶具有抗性的特征，提出 DNA分子的硫修饰可能发生在 DNA 骨架上，磷酸二酯键发生磷硫酰化成为硫代磷酸二酯键，并存在于脱氧鸟苷和脱氧腺苷之间，即 5-d(GPSA)-3 或者 5-d(APSG)-3，暗示 DNA硫修饰不像人们最初预料的那样发生在相对活跃的 DNA碱基上。 对大肠杆菌中硫修饰 DNA 分子和合成标准品进行了高压液相色谱-质谱联用、高精度质谱、紫外特征吸收色谱以及四级质谱断裂模式对比分析，最终揭示出 DNA硫修饰的化学本质，证实大肠杆菌中硫修饰 DNA 分子的确以硫代磷酸二酯键的方式、按 5-3 的方向序列特异性发生在脱氧鸟苷和脱氧腺苷之间——5-d(GPSA)-3。进一步利用对底物具有空间构象选择性的核酸酶对大肠杆菌中硫修饰 DNA 分子 5-d(GPSA)-3 进行水解；结合其在高压液相色谱中的保留时间提出 DNA 硫修饰不但具有序列选择性，还具有空间构象专一性，特异性地以 RP 构象存在。 在 Dnd 表型的发现菌变铅青链霉菌中，利用放射性硫标记、高压液相色谱-质谱、紫外特征吸收色谱以及高精度质谱分析，发现 DNA 硫修饰在不同菌属中具有不同的序列选择性。不同于大肠杆菌中的 5-d(GPSA)-3 RP，链霉菌的 DNA 硫修饰以硫代磷酸二酯键形式、RP 空间构象存在，但序列特异性发生在两个脱氧鸟苷之间——5-d(GPSG)-3。 目前已经在 100 多种微生物中观察到 Dnd 表型，并在许多广泛分布的细菌中检测到 dnd 同源基因簇的存在。通过对来自截然不同栖息地的厌氧菌 Geobacter uraniumreducens Rf4、遍在远洋杆菌 Candidatus Pelagibacter ubique HTCC1002、荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens Pf0-1、希瓦氏菌 Shewanella pealeana ATCC 700345、海洋细菌 Hahella chejuensis KCTC 2396，以及海洋杆菌 Oceanobacter sp. RED65 进行序列比对发现这些细菌的基因组中都具有 dnd 同源基因簇，包含 5 个或 4 个 dnd 同源基因。结合高压液相色谱-质谱联用分析，逐一鉴定出这些细菌都发生了 DNA 硫修饰，都5-d(GPSA)-3 RP 或者5-d(GPSG)-3 RP DNA骨架上发生磷硫酰化。说明 DNA 硫修饰不是偶然发生的生命现象，是广泛存在的具有序列选择性、空间构象专一性的新型修饰系统。 体外化学合成的硫代磷酸二酯键对很多核酸酶的酶解作用具有抗性