第九章 色谱法和高效液相色谱法.pptVIP

第九章 色谱法和高效液相色谱法 生命科学学院制药工程 各种色谱法介绍 1 高效液相色谱法 2 本章内容 第九章 色谱法和高效液相色谱法 第一节 各种色谱法介绍 一、色谱法原理：利用样品组分两相间（固定相与流动相）进行分配。流动相带着样品流经固定相，样品与固定相作用，样品组分性质差异，作用大小不同，在固定相滞留时间不同。 二、纸色谱 原理：以纸作为惰性支持物，纸纤维上OH具有亲水性吸附一层水作为固定相，有机溶剂作为流动相。 操作： 滤纸一端点样品，干后放于容器，纸饱和了溶剂蒸汽后，使溶剂从样品端经毛细作用流向另一端，样品组分分离。 三、薄层色谱（TLC） 原理：将吸附剂（硅胶、氧化铝）涂布于玻璃板，铺成薄层板，溶剂展开。 操作： 薄层板制备 薄层板活化 点样 展开 定性 定量 高效液相色谱法原理：用高压泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂缓冲液流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测物，由流动相带入柱内，由于样品组分物理化学性质不同，在固定相和流动相分配系数不同，在柱内分离，不易被固定相滞留先出柱，被固定相滞留时间长后出柱，样品组分进入检测器检测信号记录。 第二节 高效液相色谱法 装置 高效液相色谱分离模式 吸附色谱：利用样品组分吸附能力不同。 分配色谱：利用样品组分在流动相和固定相分配系数不同。 离子交换色谱：利用离子交换树脂上交换能力不同。 体积排阻色谱：利用分子大小不同，在填料上渗透程度不同。 亲和色谱：利用生物分子专一作用。 一、吸附色谱法 固定相：固体吸附剂 流动相：液体，烷烃+有机溶剂（调极性） 调节溶剂极性，控制组分保留时间 流动相极性增加，洗脱能力增加，保留时间短。 样品组分极性增加，洗脱能力下降 二、分配色谱法 固定相和流动相均为液体 利用样品组分在两相溶解度不同 正相色谱 固定相极性大于流动相极性 反向色谱 固定相极性小于流动相 三、键合相色谱法 1 正相键合色谱 ：极性基团共价结合到载体上，氨基、氰基、二醇基等。 固定相：极性较大 流动相：极性小如烷烃 极性小组分先出柱，流动相极性增加，洗脱能力增加。 2 反相键合色谱：极性小烷基共价结合到载体 固定相：C8柱、C18柱 流动相：极性大如甲醇，水，乙腈 极性大的组分先出柱，流动相极性增加，洗脱能力下降。 四、离子交换色谱法 原理：以离子交换树脂作为固定相，树脂上的离子基团与流动相中相同电荷样品组分电离生成的离子进行可逆交换，按与树脂亲和能力不同。 固定相：主要采用高分子类型填料 强碱性阴离子型（含季胺） 弱碱性阴离子型（含伯仲氨基） 强酸性阳离子型（含磺酸基） 弱酸性阳离子型（含碳酸基） 流动相：以水作流动相为主，为增加某些组分溶解度，加入少量有机溶剂。 离子交换色谱保留值和分离度主要通过控制流动相的pH值和离子强度。 流动相pH值：可改变离子交换基上可解离的H+，OH-，对于阳离子交换剂pH值降低，交换剂离子化受到抑制，交换容量降低，组分保留值减小。 离子强度：样品离子与加入盐离子争夺离子交换基上反电荷位置，流动相离子强度增大，样品离子争夺减弱，组分保留值降低。 影响因素：填料孔径，柱长，流速，pH值，离子强度。 五、体积排阻色谱法 色谱柱填料是凝胶，大分子可渗入凝胶大孔，不能进小孔，也可能大小孔都不能进入，小分子大孔小孔都可进入，大分子先洗脱。 固定相：甲基丙烯酸类共聚物树脂 交联聚乙烯醇类树脂 高交联琼脂糖树脂等 苯乙烯二乙烯苯共聚物 多孔球形硅胶 流动相：通常采用甲苯，四氢呋喃和氯仿等有机溶剂，水作基体，不同pH值缓冲液作流动相。 染料木苷和黄豆苷标准品HPLC色谱图 黄豆苷和染料木苷的保留时间分别是5.208min和6.720min. 黄豆苷元与染料木黄酮的保留时间分别是5.464min和7.316min。 大豆异黄酮粉HPLC色谱图 染料木黄酮和黄豆苷元标准品HPLC色谱图