离心并贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞的成骨特性论文.docVIP

　　离心并贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞的成骨特性论文 张文鹏 叶发刚 禇言琛 【摘要】 目的 观察密度梯度离心并贴壁培养法体外分离纯化兔骨髓间充质干细胞的效果，以及诱导后的兔骨髓间充质干细胞的成骨特性。方法 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离兔骨髓间充质干细胞。采用倒置显微镜进行形态学观察、免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原；经成骨培养液诱导培养后，对碱性磷酸酶活性、细胞矿化形成钙化结节的能力进行测定。结果 分离的骨髓间充质干细胞24 h后贴壁，贴壁细胞平均10 d形成克隆，细胞表型稳定。诱导条件下，细胞碱性磷酸酶活性明显增高，Von.Kossa染色可见矿化结节。结论密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化兔骨髓间充质干细胞，用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性。 【关键词】 骨髓；间质干细胞；细胞培养技术；成骨分化；兔 ［ABSTRACT］ Objective To observe the effect of in-vitro isolation and purification of rabbit bone marroesenchymal stem cells （rBMSCs） by density gradient centrifugation （DGC） and attachment culture, and the osteogenic characteristics of induced rBMSCs. Methods rBMSCs icroscopically. rBMSCs membrane antigens munocytochemical technique. After the rBMSCs edium, the activity of the alkaline phosphatase （ALP） and ability to form mineralized nodus ined.Results The isolated rBMSCs began to adhere after cultured for 24 hours, the attached rBMSCs began to form clone at average of 10 days and the phenotype of rBMSCs ent method can effectively isolate and purify rBMSCs. The cells cultured ics of BMSCs. ［KEY SCs）具有较强的增殖活性。研究表明.freela公司），大鼠抗兔CD34-FITC、CD29-FITC（北京中山生物公司）。 1.1.3 成骨诱导液 包含基础培养液（内含体积分数0.10 胎牛血清、 低糖DMEM、100 U/L 青霉素、100 U/L链霉素），10 mmol/L的β-甘油磷酸钠，10-7 mol/L 地塞米松，50 mg/L维生素C。 1.2 方法 1.2.1 BMSCs分离和培养 兔用30 g/L戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉，髂后上嵴处备皮。无菌术抽取肝素抗凝骨髓约5 mL，加入5 mL的L-DMEM培养液混匀，以1 000 r/min离心5 min，弃去上清液。 以5 mL L-DMEM培养液重悬细胞。将1.077 kg/L Percoll 分离液先置于试管的底部,然后按照1∶1 的比例缓慢滴加稀释后的骨髓，以2 500 r/min 离心30 min,收获界面层的单核细胞。将其重悬于含体积分数0.10胎牛血清的L-DMEM培养液中，接种于25 cm2培养瓶内,浓度1.0×108/L,置于37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱内孵育，每2～3 d换1 次液。待细胞生长至瓶底90%汇合时,进行传代。然后取第3代细胞进行成骨诱导培养，实验组加入诱导分化培养液，对照组加入等量基础培养液，每3 d换液1 次。 1.2.2 细胞观察 倒置相差显微镜观察体外培养细胞的生长、增殖及细胞形态的变化情况。 1.2.3 BMSCs生长曲线绘制 取1、3、5、7代兔BMSCs，消化，加入L-DMEM完全培养液，接种于24孔培养板中，作相应标记（P1、P3、P5、P7）。细胞计数，计算均值，连续9 d。Microsoft Excel XP软件绘制细胞生长曲线。 1.2.4 BMSCs表面抗原分析 第3代细胞消化、计数、离心，加入200 μL PBS制成细胞悬液。设置阴性对照，加入大鼠IgG1-FITC，其他管加入大鼠抗兔CD34-FITC、CD29-FITC，细胞与荧光素-共轭抗体抗CD29、CD34，在黑暗中孵化15 min。流式细胞仪检