ELISA技术及其在猪病诊断中的应用.docVIP

ELISA技术及其在猪病诊断中的应用 周荷田1 杨丹凤1 张志庆1 罗敏娟1 吴树华2 高洋根1* (1.南昌金牧动物动物保健服务有限公司，南昌 330013） （2.永丰县农业局 永丰 331500 ） 摘要：nzyme-linked immunosorbent Assay,ELISA）和病毒中和试验等。其中，ELISA技术是现代养猪业应用最广、发展最快的一项血清学诊断技术。其特点是灵敏度高、特异性强、安全性高以及操作简单，从而适用于大规模猪场的抗体水平检测或者临床大量样品的检测。本文就ELISA技术的原理及其在猪病诊断中应用 关键词：ELISA技术；猪病诊断；问题 酶联免疫吸附试验(ELISA)，是目前应用最广、发展最快的免疫检测技术，它不仅只应用于动物疫病的诊断，也是监测各病原抗体水平的主要手段，从而对免疫质量进行评估，有效地进行动物疫病的预防(1(。在动物疫病防控的临床实践工作中，ELISA技术扮演了重要的角色，发挥其有效的疫病监测作用，进而促进了我国畜牧业稳健和长远的发展(2(。实际工作中，特异性的抗体检测为兽医工作者了解动物疫病防控、治疗效果及预后的情况提供了有效数据。在生物的免疫应答的过程中，其体液免疫和细胞免疫是相互影响、相互促进的过程，动物在初次接种疫苗一定时间后，其体内就会形成相应的有效抗体，此时通过采集血清样品进行抗体检测，获得有效的抗体水平数据，就可以对该猪场的免疫效果进行有效的评估，从而判断其疫苗质量、免疫程序甚至其免疫手段是否合理。同样地，动物感染了相关病原，其体内形成相应的抗体也可以通过抗体检测得到相关数据，进而可以为诊断、治疗动物疫病提供必要的依据，从而提高治疗效果，并为后期的疫病防控工作奠定了基础。由此可见，ELISA技术在我国畜牧业有着举足轻重的价值。 1 ELISA ELISA反应原理Horseradish Peroxidase,HRP），其次为碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ,AKP）。用于包被的抗原或抗体能牢固地吸附于固相载体表面，并保持其免疫活性。检测时，待检样品与吸附于固相载体表面的已知抗原或抗体结合，然后洗去包被板孔内游离的反应物，加入酶标抗原或酶标抗体即可在载体上进行免疫酶反应，洗去未结合的酶标，加入底物四甲基联苯胺（TMB）显色后加终止液。此时产物的量与样品中待检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析(3(。由于酶的高效率催化，因此反应结果可以被放大，所以ELISA试验结果可用肉眼观察，也可用测定仪在特定的分光光度值下测定样本的光密度（OD）值(4(。 ELISA反应基本 直接法 最简单的ELISA反应，将抗原或抗体包被于固相载体表面，实验时直接加入酶标抗原或酶标抗体进行反应，可用于直接检测抗原或者抗体。 间接法 将已知抗原包被在微量反应板上，待检样品在反应孔内孵育时，针对特异性抗体与包被的抗原形成抗原抗体复合物。洗去未结合的物质后加入辣根过氧化物酶标记的抗抗体，它与反应孔中的抗体结合。洗去其他游离成分，再加入TMB底物显色。颜色的深浅与样品中存在的抗体成正比。本法主要用于测定抗体，其优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。 夹心法 又称双抗体法，将纯化的特异性抗体包被于固相载体，加入待检抗原样品，温育后洗涤，加入酶标记的特异性抗体，没有结合的酶标抗体结合物被洗去，加入TMB底物显色，产物颜色的深浅与样品中的抗原含量成正比。此方法用于测定大分子抗原。 双夹心法 将抗体（Ab1）吸附在固相载体上，洗去未吸附的抗体，加入待测抗原（Ag）样本，其与固相载体上的抗体结合后，洗去未结合的游离物质，加入不同动物制备的特异性相同的抗体（Ab2），此时，Ab2会与待测抗原结合，再次洗涤后加入酶标记的抗Ab2抗体（Ab3），其结合在Ab2上后即形成了Ab1-Ag-Ab2-Ab3-HRP复合物。洗涤后加入底物显色，产生的颜色深浅与样本中的抗原呈正比(5(。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。其优点是不必标记每种抗体，还能提高实验的敏感性。 阻断ELISA 用抗原包被固相载体，加入待检样品，然后加入酶标单克隆抗体，最后加底物显色。呈色反应的深浅与样品中的抗原呈反比，主要用于测定抗体。 2 ELISA在猪病防控中的应用 2.1 ELISA在猪细菌性疾病诊断中的应用 周明光(6(用改良的方法提取猪2型链球菌的荚膜多糖，将其包被于微量反应板上，建立了间接抗体检测方法，同时通过试验优化了其反应条件，进行了敏感性、特异性、重复性、保存期试验等研究，研制出猪型链球菌间接ELISA抗体检测试剂盒。间接ELISA试验具有很