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微生物学模块三大肠杆菌的分离与培养 一、实验目的 1、 掌握制平板的方法和几种分离、培养的基本方法。 2、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术 二、实验原理 在自然界，微生物通常都是和其它不同的微生物混在一起生活的。如果要观察、研究和利用某一种微生物，就需要把它从它在自然界中和其它微生物一起生活的环境中分离开来，再在人工控制条件下，用培养基培养单一种微生物，即纯培养。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。 分离纯种的方法： 主要有平板划线分离法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法和单细胞分离法等。 单细胞分离法法 ： 它需要特制的显微操纵器或其他显微技术，因而其使用受到限制。简易单孢子分离法是一种显微单孢操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。 平板分离法 ： 该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。 其基本原理包括两方面： 1. 选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 2. 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得 三、什么是培养基： 培养基是按照微生物生长发育的需要配制的适 合微生物生长的营养物质。 人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一 个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器 皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。 四、培养基配制原则： 1、适当的组分和比例的营养物质（特别是碳氮比 （ C/N ）） ； 2、适当的pH值； 3、合适的渗透压； 4、保持无菌状态； 5、经济节约 。 五、常用的细菌培养基LB （牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 氯化钠 3g 蒸馏水 1000 ml 琼脂 20g pH 7.2～7.4 六、实验步骤 1、菌悬液的制备 （1） 取含有大肠杆菌的菌源5 g，放入装有45 mL无菌水的三角瓶中，振荡10 min，即为稀释10-1的含有大肠杆菌的菌悬液。 （2）另取装有9 mL无菌水试管若干，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等。取已稀释成10-1菌悬液，振荡后静止5 min，用移液枪取1 mL菌悬液加入10-2无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2菌悬液。同法由10-2的试管中吸取1 mL稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3菌悬液，依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6等稀释液。 （3）在检样稀释过程中，可用一支枪头由浓到稀，稀释到底。 2、稀释混合平板法： A、取无菌培养皿若干付，先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、分离人。 B、取一吸管，以无菌操作法吸取不同的稀释液1mL，加入无菌培养皿。 C、取已熔化的在水浴锅中保温50℃左右的培养基，分别倒入上述培养皿中，轻轻转动培养皿，使菌液和培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于一定温度下恒温培养一定的时间。观察菌落形态以及计数菌落。并计算出菌的数量。 D、挑取单个菌落，接种到斜面培养基上作纯化和性能测定，若不纯，需要继续分离。 3、稀释涂布平板法 A、取无菌培养皿若干。在皿底贴上标签，注明分离菌名、稀释度和分离者。 B、取已熔化的培养基，倒入培养皿，制成平。 C、凝固后，取一支吸管吸取菌悬液0.1mL于平板上。 D、用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。倒置于一定条件下培养，观察菌落形态及计数菌落，并计算出菌的数量。 E、挑取单个菌落，接种于相应的斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，至最后得到纯培养。 4、平板划线法 A、取无菌培养若干付，在皿底贴上标签，注明事项。取已 熔化的