实验七_植物dna的提取与纯度鉴定.ppt

植物DNA的提取与纯度鉴定 谢 艳 实验目的 实验原理 实验材料 实验试剂 实验仪器 实验步骤 注意事项 实验目的 了解植物总DNA提取的原理 学习和掌握提取、纯化高等植物总DNA的方法和步骤 核酸的理化性质 DNA和RNA都是极性化合物，一般都溶于水或1mol/L的NaCl溶液中，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。核酸的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在。 DNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠中溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。 不同生物须选择不同DNA提取方法 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取难易度不同： 对于低等生物，如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA分子量较小，提取时易保持其结构完整性。 从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA 分子量较大，一般达2×10 道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核DNA 外，还有质粒DNA 等。 同一生物不同部位DNA含量不同 为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从同一生物的不同的部位提取DNA。但由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。 如动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子；植物种子的胚中都含有丰富的DNA。 如微生物中，谷氨酸菌体含7%-10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%-10%。 真核细胞基因组提取的方法 浓盐法 离子去污剂法 苯酚抽提法 水抽提法 CTAB法 CATB法的简析 冷冻和研磨，使细胞破裂 加入CTAB提取缓冲液，溶解DNA 氯仿/异戊醇抽提，去除蛋白 加入无水乙醇/异丙醇，沉淀DNA 酒精冲洗，去除剩余杂质 RNase消化，去除RNA 无菌水/TE溶解，保存DNA CTAB法实验原理 离子型表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等可以有效裂解植物细胞壁，且与DNA形成可溶于高盐溶液的复合物，当降低盐浓度时DNA又可沉淀析出，从而与蛋白质及多糖等分离。 具体 CTAB、SDS等离子型表面活性剂能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚 / 氯仿等有机溶剂，使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇 / 无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE或水溶液中，即得植物总DNA溶液。 实验材料 烟草嫩叶 实验试剂及其配置 实验试剂及其配置 实验试剂及其配置 0.5 M pH 8.0 EDTA (乙二胺四乙酸 ) （要求配100mL） 29.22 g EDTA溶于140 mL水中，用固体NaOH调pH至8.0，补ddH2O定容至200 mL。 作用：EDTA螯合二价离子，抑制DNA 酶的活性，保护DNA 实验试剂及其配置 CTAB/NaCl (10% CTAB, 0.7 M NaCl) （要求配50mL） CTAB 20 g NaCl 8.2 g 加入160 mL ddH2O，加热至65℃溶解，补dd H2O定容至200 mL，高压灭菌。 注意：此溶液很粘稠，使用时需加热至65℃。 实验试剂及其配置 5 3 M NaAC pH 5.2 （要求配50mL） 81.62 g NaAC·3H2O / 49.22 g 无水NaAC溶于160 mLddH2O中，冰乙酸调pH至5.2，定容至200 mL，高压灭菌。 作用：Na离子中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，使沉淀更完全。 实验试剂及其配置 6 高盐TE溶液（pH 8.0） （要求配50mL） 实验试剂及其配置 7 24：1的氯仿（三氯甲烷）/异戊醇 （要求配50mL） 氯仿变性蛋白质，异戊醇消除气泡 注意：混匀过程要轻柔，以免DNA