SSR分子标记实验操作及其注意事项.docVIP

SSR分子标记实验操作 一、试剂配制 0.2%亲水binding silence（现配现用）1500μL95%乙醇，7.5μL冰醋酸，再加入3μLbinding silence，混匀后使用。 0.5%疏水repel silence（购买后可直接使用）TBE母液（5×TBE）Tris Base,54g;硼酸7.5g;EDTA(0.5M pH8.0),20ml.搅拌溶化，定容至1000ml，无需灭菌，室温保存，母液的pH值应保持在8.3左右。 Urea－TBE(一块胶板用量)： 5×TBE12ml;尿素27g.加双蒸水溶解后定容至51ml，使用漏斗过滤。 40％丙烯酰胺丙烯酰胺380g;甲叉双丙烯酰胺20g.加热至37℃使之溶解，加水定容至1000ml，用醋酸纤维素滤膜（入Nalge滤器，0.45μm孔径）过滤，棕色瓶避光保存于室温。 10％APS（过硫酸铵）超纯过硫酸铵2g;超纯水18ml.溶解后，4℃保存。 TEMED（购买后可直接使用）电泳级的TEMED可购自Bio-Rad，Sigma或其他供应商。 Loading buffer：去离子甲酰胺50ml;0.5MEDTA(pH8.0),1ml;二甲苯腈蓝cyanol0.125g;溴酚蓝0.125g.混匀后置于4℃保存。 固定液：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸的固定液。 染色溶液(ACS 试剂)：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml，AgNO3 1g。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3的染色液。 显影溶液：15g NaOH，0.5ml 甲醛，水500ml。终浓度为3％NaOH，0.1%甲醛。 三：实验步骤 1、玻璃板清洗： 1）用洗涤剂把玻璃反复擦洗干净，用酒精擦干、干燥。在疏水玻璃板上均匀涂上300-500μL的0.5%的疏水剂Binding Silane。可放置过夜。 2）配制凝胶前，在亲水玻璃板上均匀涂上2％的亲水剂Repel Silane，保证玻璃板的每个地方都涂上亲水剂，晾干至少5min，然后用酒精轻轻擦拭以去掉多余的亲水剂。 3）玻璃板彻底干燥后进行玻璃板组装。两块玻璃板两边边缘割伤配套的硬纸条，橡皮夹子夹住两边，在橡皮夹子里加上硬纸片可以保证玻璃板的水平，可以有效地防止条带跑歪。下边套上有旋钮的塑料套，旋紧旋钮，以防止底下漏胶在插入梳子的位置插入一个硬纸条以保证上方凝胶界面水平且整齐。 4）将装好的玻璃板水平放置于桌面上，亲水玻璃板至于下面，而带电极的疏水玻璃板朝上，保证玻璃板的水平。 2、聚丙烯酰胺凝胶的制备 1）每一块胶的用量配制如下：（大胶） Urea－TBE 51ml 40%丙烯酰胺 9ml 10%APS 400μl TEMED 30μl 共计 约60ml 2）迅速轻轻摇匀，注意不要用力搅拌，混匀后立即灌胶。 3）将混合液导入大注射器中，将导管中气泡挤出，迅速将导管口插入灌胶口，在重力作用下，混合液流入两块玻璃板之间，人为控制流速以防止气泡产生。 4）灌胶完成后，聚合时间至少在1小时，若凝胶要放置过夜，则须在凝胶两头铺上湿滤纸（以1×TBE浸湿）以防止凝胶变干。4℃保存，凝胶使用之前可保存1-2天。 3、凝胶电泳 1）正极槽（底下）中加入600ml的1×TBE缓冲液，组装上配好凝胶的玻璃板，拔去维持凝胶上方水平的硬纸条，负极槽上加入800ml的0.5×TBE缓冲液直至覆盖了凝胶上方。 2）将凝胶上方多余的胶用枪冲洗干净，并将气泡清除。 3）预电泳30min，保持在恒定功率55W（相当于电压1441V，电流38mA）。 4）预电泳完成后，关闭电源，用枪将凝胶上方多余的气泡和胶清除干净，插入梳子，再用枪将梳子中的气泡清除干净。 5）加入3μl已由loading buffer处理过的样品DNA，每块板子可点1-3个Marker，55W恒定功率电泳1.5h，至第一条Loading buffer指示带（二甲苯青带，约相当于260bp双链DNA）跑至胶板的2/3处（距底部1/3处）时停止电泳。 6）通过带电极玻璃板中部的出水孔排出0.5×TBE缓冲液，剩余的0.5×TBE缓冲液直接倒掉，缓冲液可反复使用几次。 7）小心的分开两块玻璃板，这时凝胶会粘连在涂有亲水剂的玻璃板上。 4、银染 1）将带凝胶的玻璃板浸在固定液（10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸）中20min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方。 2）将玻璃板取出，浸在染色液（10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3 (ACS 试剂)）中15min，凝胶朝下放置，玻