蝉花中ＩＳＰ 类免疫活性组分含量测定的研究论文.docVIP

　　蝉花中ＩＳＰ 类免疫活性组分含量测定的研究论文 .freelination of ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＩＳＰ －ｌｉｋｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｌ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｉｎ C．cicadae．MethodsＴｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＩＳＰ －ｌｉｋｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ．Ｔｈｅ ｖａｌｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｖｅｒａｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｏｍｅ ｉｎｄｅｘｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ａｎｄ ｒａｎｇｅ ， ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ， ｓｔａｂｉｌｉｔｙ..毕业， ａｎｄ ａｃｃｕｒａｃｙ．ResultsＴｈｅ linear ｒａｎｇｅ ｗａｓ ６ ～３０ μｇ／ｍｌ， ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ０．９９９７， ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｗａｓ １０１．２０％， ａｎｄ RSD ｗａｓ ０．７９％．ConclusionＴｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ， ｒａｐｉｄ， ａｃｃｕｒａｔｅ， ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ. It can be used for the ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ of the ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＩＳＰ －ｌｉｋｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｌ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｉｎ C．cicadae． Key words：Cordyceps cicadae； ＩＳＰ； Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ 蝉花是我国传统的一种名贵中药，与冬虫夏草一样同属虫菌复合体，且含有相近的化学成分，医家常将其用作冬虫夏草的代用品。医学研究表明，它具有显著的免疫调节、抗疲劳和改善肾功能的作用［１］ 。而有关蝉花药理物质基础的报道仍然较少［２］ 。Ｆｕｊｉｔａ 等［３］ 通过细胞模型从蝉花培养滤液中筛选得到的免疫活性成分ＩＳＰ －１，具有显著的双向免疫调节作用，免疫抑制力比环孢菌素Ａ 更强且副作用小［３，４］ 。由于蝉花ＩＳＰ 类次生代谢产物含量较低，难以检测，目前尚未见定量测定其含量的报道。基于ＩＳＰ 类物质为长脂链α－氨基酸，与茚三酮共热时生成蓝紫色的酮茚胺，在一定范围内吸光度和氨基酸含量成正比［５］ ，本研究采用茚三酮比色法定量测定蝉花ＩＳＰ 类物质的含量，建立起一种快捷有效测定ＩＳＰ 类物质的方法。 1 器材与方法 1.1 仪器与试剂ＵＶ －１６０１ 紫外可见光分光光度计（日本ＳＨＩＭＡＤＺＵ）；ＪＡ１００３Ａ 电子天平（上海精天电子仪器厂）；２０１ 型升降恒温水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；ＮＫＡ 非极性大孔吸附树脂（天津南开大学化工厂）；６２３０Ｍ 型ｐＨ 酸度计（上海洪纪仪器设备有限公司）；Ｌ －丝氨酸（上海康达氨基酸厂）；茚三酮（上海三爱思试剂有限公司）。其余试剂均为分析纯，水为去离子水。 1.2 方法 1.2.1 样品溶液制备蝉花菌培养滤液２ Ｌ 上大孔吸附树脂ＮＫＡ 柱，柱高２３ ｃｍ，内径２．８ ｃｍ。分别用水２ Ｌ，５０％乙醇２ Ｌ洗柱，直至流出液无色，流出液弃之，再用１ Ｌ 乙醇洗脱，收集流分，减压浓缩至干，１０ ｍｌ 甲醇溶解。进行比色测定时，取１ ｍｌ 甲醇溶液乙二醇甲醚稀释５０ 倍。 1.2.2 比色测定方法参见文献［６］，略作改进。准确称量丝氨酸３．０ ｍｇ，用水湿润溶解后转入１００ ｍｌ 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得３０ μｇ／ｍｌ 丝氨酸对照溶液。吸取一定量丝氨酸对照溶液或样品溶液于２０ ｍｌ 具塞刻度试管中，不足１．０ ｍｌ 则用水补足，依次加入１．０ ｍｌ 醋酸－乙酸钠缓冲溶液（ｐＨ５．４），１．０ ｍｌ １％茚三酮乙二醇甲醚溶液，０．１ ｍｌ ０．１％抗坏血酸溶液，摇匀，盖上塞，于９０℃水浴加热３０ ｍｉｎ，取出冷水冷却１５ ｍｉｎ，加入３ ｍｌ ６０％乙醇稀释，摇匀，以试剂空白为参比，在５６７ ｎｍ 处测量其吸光度Ａ５６７ｎｍ 。 1.2.3 薄层检测准确称量丝氨酸３．０ ｍｇ，加入２ ｍｌ 水溶解作为薄层点样液。吸取上述点样液５ μｌ，样品甲醇溶液４０ μｌ，分别点于同一硅胶ＧＦ２５４ －ＣＭＣＮａ 薄层板上，０．２％茚三酮－乙醇溶液喷雾，１１０℃加热显色。再吸取样品甲醇溶液４０ μｌ，蝉花发酵液１０ 倍浓缩液４０ μｌ 分别点于之前同一薄层板上，以氯仿－甲醇－水（６５∶３０∶５）为展开剂展开，取出晾干，０．２％茚三酮－乙醇溶液喷雾，１１０℃加热显色。 2 结果与讨论 2.1 最大吸收波长的确定分光光度法测定物质含量时，首先须确定反应体系的最大吸收波长。分别精密吸