融合基因GMCSFBZLF1重组腺病毒表达载体的构建论文.docVIP

　　融合基因GMCSFBZLF1重组腺病毒表达载体的构建论文 崔瑛 王云 刘成玉 张东峰 【摘要】 目的 构建粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和EB病毒即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法 采用逆转录聚合酶链反应分别获得GMCSF和BZLF1编码序列的cDNA，应用剪接式重叠延伸(SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3 的DNA 序列进行连接，构建融合基因GMCSFBZLF1。将融合基因GMCSFBZLF1定向亚克隆至pAdTrackCMV质粒，在原核细胞E. coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy1的同源重组，构建融合基因GMCSFBZLF1真核表达载体pAdGMCSFBZLF1。将真核表达载体pAdGMCSFBZLF1转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vAdGMCSFBZLF1。RTPCR鉴定感染重组腺病毒的293细胞中GMCSFBZLF1基因的表达。结果 GMCSFBZLF1基因插入重组腺病毒表达载体的预期位置，且插入序列完全正确;感染重组腺病毒vAdGMCSFBZLF1的293细胞中检测到融合基因GMCSFBZLF1的转录表达。结论 成功地构建了融合基因GMCSFBZLF1重组腺病毒表达载体，为进一步探讨GMCSFBZLF1的功能提供了理论基础和实验依据。 【关键词】 疱疹病毒4型.freelan granulocytemacrophage colonystimulating factor (GMCSF) gene and EBV encoding immediate early genes (BZLF1) fused to GMCSFBZLF1 gene and the fusion gene rebinant adenovirus expression vector. Methods GMCSF cDNA and BZLF1 cDNA id. The shuttle plasmid and the backbone plasmid pAdEasy1 ologously in E.coli BJ5183 cells, then fusion gene eukaryotic expression vector pAdGMCSFBZLF1 onstrated that GMCSFBZLF1 gene inserted in the expected site in the rebinant adenovirus expression vector and the insertion sequence ight furnish the rationale and experimental evidence for further study on the function of GMCSFBZLF1 gene. KEY CSF)主要由T细胞和巨噬细胞产生，是一种具有多种生物学活性的细胞因子，将GMCSF基因转入肿瘤细胞内，可以提高其免疫原性从而诱导有效的抗肿瘤免疫应答6。本研究拟将GMCSF编码基因和BZLF1进行融合，进而构建融合基因的重组腺病毒表达载体，深入探讨融合基因表达对EBV阳性肿瘤细胞增殖的影响，从而为基因联合治疗EBV相关肿瘤提供实验基础和理论依据。 1 材料和方法 1.1 主要试剂、质粒和细胞系 限制性核酸内切酶EcoRⅤ和BglⅡ，T4 DNA连接酶，DL 10 000 DNA Marker，DL 2 000 DNA Marker，Taq DNA聚合酶，均购自宝生物工程(大连)有限公司;DNA转染试剂盒Lipofectamine 2000 购自Invitrogen公司;质粒提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。DMEM培养液、TRIzol、胎牛血清购自美国GIBCO公司。反转录酶为Promega公司产品。QIAEXⅡ纯化试剂盒购自QIAGEN公司。携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV，E1 区和E3 区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdEasy1，大肠杆菌BJ5183和DH10B以及人胚肾293细胞，由中国疾病控制中心性病艾滋病中心病毒免疫室邵一鸣教授惠赠。EBV阳性B958细胞系日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠。 1.2 引物设计 根据GMCSF和BZLF1开放读码框序列，以DNAStar软件设计扩增人GMCSF和EBV BZLF1 基因的特异性引物，并在GMCSF上游引物的5′ 端引入BglⅡ酶切位点和保护性碱基GA，下游引物3′