融合毒素TOP3表达载体的构建.docVIP

　　融合毒素TOP3表达载体的构建 【摘要】 目的构建融合毒素TOP3的原核表达载体，为研究该融合毒素的功能及分析评价临床应用前景奠定基础。方法 构建原核表达载体pET-28a(+)-TAT-ODD-CASPASE3[pET-28a(+)-TOP3]，并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内诱导表达。结果 经酶切分析及DNA序列分析，所构建的质粒均插入TAT-ODD-CASPASE3融合基因。结论 成功构建原核表达载体pET-28a(+)-TOP3，并在IPTG诱导下获得特异性表达。 【关键词】 TOP3 原核表达载体 克隆 　CONSTRUCTION AND EXPRESSION OF A FUSION TOXIN TOP3IN PROKARYOTIC EXPRESSION SYSTEM 　　Liu Fang, Dang Guoquan 　　(Dept. of Biochemistry, Qinghai University Medical College) 　　Abstract Objective 　　To construct and express fusion toxin TOP3 in order to develop a targeted toxin that capable of eliminating abnormal cells, for example, cervical carcinoma cells. Methods The expression prokaryotic plasmids pET-28a (+)-TAT-ODD-CASPASE3 〔pET-28a(+)-TOP3〕 ed pET-28a (+)-TOP3 into E. coli BL21(DE3)pLysS strain to be induced by IPTG. The obtained proteins ids ed id expressed an extra band. Conclusion The present study has successfully constructed prokaryotic expression victor of pET-28a (+)-TOP3 andgained specific expression induced by IPTG . 　　Key ain),即蛋白转导结构域[1,2]。TAT蛋白PTD的核心序列由11个氨基酸组成，其序列为YGRKKRRQRRR，该转导序列能够有效引导肽段或者蛋白质进入细胞，具有蛋白传送功能，且转导速度快、效率高。 　　HIF-1(hypoxia inducible factor-1) 是公认的缺氧调节中的核心因子,其生物学活性由HIF-1alpha;决定，在HIF-1alpha; 401-603区域为氧依赖降解区(Oxygen dependent degradation domain,ODD)，常氧时借助402、564位脯氨酸羟化，通过激活泛素-蛋白酶体途径使HIF-1alpha;迅速降解;而肿瘤细胞处于缺氧状态时，以上HIF-1alpha;降解途径被阻断[3-5]，HIF-1alpha;累积而更有效发挥其生物学活性来调节下游众多基因的表达。 　　借助于人类免疫缺陷病毒HIV-1 Tat-PTD区的转导功能、HIF-1alpha;ODD区的氧调节作用、天冬氨酸异性半胱氨酸蛋白酶3(Cysteinylaspartate specific protease 3, Caspase3)在细胞凋亡途径中的中枢作用，本研究构建了特异性表达于低氧细胞的融合毒素TOP3的原核表达载体。这对于探索具有诱导肿瘤细胞凋亡作用的目的蛋白，如何有效并且特异性地在低氧恶性实体瘤细胞中发挥生理功能具有重要的意义，同时也为应用该融合毒素治疗恶性实体瘤的研究奠定了基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　DH5alpha;感受态细胞购自道普生物科技(北京)有限公司;pET-28a(+)、大肠杆菌BL21(DE3)菌株购自Novagen公司; 10%胎牛血清购自Hyclone公司;DMEM培养基、Trizol试剂购自Invitrogen公司; MmLV逆转录酶购自Promega公司;Taq DNA聚合酶购自Takara公司;EcoRⅠ、SalⅠ、NotⅠ、XhoⅠ核酸内切酶，T4连接酶购自Bio-Rad 公司。BGC823细胞由北京肿瘤医院分子生物学实验室馈赠。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养：BGC823细胞用含5%FBS的DMEM培养液培养，同时在培养液中加入青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 mu;g/mL)。细胞按常规条件(37℃，5% CO2 ，恒定