蟾蜍灵在诱导HL60细胞凋亡过程中对Bcl2和PKC的影响论文.docVIP

　　蟾蜍灵在诱导HL60细胞凋亡过程中对Bcl2和PKC的影响论文 【摘要】 为了研究蟾蜍灵在诱导HL60细胞凋亡过程中对Bcl2表达与裂解和磷酸化的作用，及对蛋白激酶C（PKC）活性与PKCs亚细胞定位的影响，分别采用台盼蓝拒染法检测细胞生存率，细胞染色法观察凋亡形态，流式细胞术分析细胞周期，琼脂糖凝胶电泳检测凋亡DNA片段化，［γ32P ］同位素掺入法测定PKC活性，I 1640培养液购于Gibco公司；胎牛血清购于中国医学科学院血液学研究所；小鼠抗人Bcl2抗体购于Santa Cruz公司；兔抗人PKCα、βⅠ、βⅡ 抗体、碱性磷酸酶标记山羊抗兔抗体、马抗小鼠抗体均购于北京中山生物技术有限公司；兔抗人GAPDH抗体购于上海康成生物工程有限公司；［γP32］ATP购于北京亚辉生物医学工程公司； 100 bp DNA Ladder购于上海生工生物技术服务公司。 人髓性白血病HL60细胞由Ueda教授（福井医科大学）提供，生长于含经56℃、30分钟灭活的10%胎牛血清、12 U/ml庆大霉素的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内传代培养。所有实验均采用对数生长期细胞。用1-100 nmol/L蟾蜍灵作用HL60细胞0-72小时，采用台盼蓝拒染法测定细胞增殖能力并绘制增殖曲线。 细胞形态学分析 用不同浓度的蟾蜍灵作用HL60细胞，制成细胞涂片，瑞氏姬姆萨染色，光学显微镜下观察细胞形态。 流式细胞术解析 将细胞用冷PBS离心洗涤后，加入体积比为70%的冷乙醇，4 ℃过夜。加入RNase（200 μg/ml）37 ℃孵育1小时，在加入碘化丙锭（20 μg/ml）4 ℃避光30分钟后，进行流式细胞仪解析，采用CELLQuest软件进行细胞周期分析。 亚细胞成分的分离及PKC活性测定 离心收集5×107细胞，加入1 ml缓冲液A［20 mmol/L TrisHCl （pH 7.4）、 10 mmol/L EDTA、 2 mmol/L EGTA、 100 μg/ml PMSF、 2 μmol/L抑酞酶、 2 μmol/L胃酶抑素及0.25 mol/L 蔗糖］，超声粉碎5次，每次20秒，100 000 ×g离心1小时，上清为胞浆部分。在沉淀中加入1 ml含0.1％Triton 100的缓冲液A，按上述方法超声粉碎，4 ℃裂解30分钟后离心（同上），上清为含胞膜部分。用Loan P81强阳离子交换滤纸上，在75 mmol/L磷酸溶液中洗3次终止反应，烘干后放入装有10 ml蒸馏水的液闪瓶中，用Beckman 1801型液闪仪进行液闪测定［4］。PKC的活性以30 ℃时每g酶蛋白每分钟催化［γ32P］掺入底物蛋白的量，即nmol /（min·g）蛋白表示，总活性为胞浆与含胞膜部分活性之和。 DNA 凝胶电泳 离心收集2×106细胞，加入100 μl溶解缓冲液（20 mmol/L EDTA、 100 mmoll/L Tris(pH 8.0)、 0.8％ SDS）， 4 ℃放置10分钟。15 000×g离心5分钟后，在上清中加入RNase (终浓度为0.2 mg/ml)， 37℃孵育1小时，加蛋白酶K(终浓度为2 mg/ml)， 55 ℃过夜。加入异丙醇120 μl混匀后，12 000×g 离心10分钟，在沉淀中加入20 μl TE缓冲液混匀，室温下溶解30分钟后，在1.5％的琼脂糖中进行电泳（50 mV, 1.5小时）。电泳结束后EB染色，Tanon GIS 2020凝胶成像系统分析并拍照。 SF、 2 μg/ml aprotinin 的 RIPA裂解液中（0.1% SDS、1% 脱氧胆酸钠、1% Triton100、 150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L TrisHCl pH7.4），4℃裂解1小时， 15 000×g离心30分钟。取上清，采用Lool/L蟾蜍灵处理HL60细胞24，48及72小时，蟾蜍灵以时间、剂量依赖方式抑制HL60细胞增殖(P 0.05)，24、48及72小时抑制细胞增殖50％的药物浓度（IC50）分别为(25.8±2.1)，(8.0±1.2)及(2.3±0.3) nmol/L（图1）。 Figure 1. Inhibition effect of bufalin on groes. 蟾蜍灵诱导HL60细胞凋亡 用50 nmol/L蟾蜍灵处理24小时，形态学观察表明HL60细胞出现典型的凋亡形态学变化，表现为细胞核碎裂，并出现凋亡小体（图2）。50 nmol/L蟾蜍灵分别处理HL60细胞6，12 及24小时，流式细胞仪解析表明，因凋亡形成的亚二倍体 (subG1) 细胞分别为1