褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的tau蛋白过度磷酸化的影响论文.docVIP

　　褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的tau蛋白过度磷酸化的影响论文 【摘要】 目的 探讨褪黑素(Mel)对花萼海绵诱癌素(CA)在成神经瘤细胞诱导的tau蛋白过度磷酸化的影响及其机制。方法 采用鼠野生型成神经瘤细胞(N2aol/L Mel处理，用免疫荧光检测tau蛋白磷酸化水平，32P特异底物标记技术检测GSK3活性，免疫印迹技术检测PSer9GSK3β和GSK3β的表达水平，计算PSer9GSK3β/GSK3β的比率。结果 ①CA可在N2aelatonin on calyculin Ainduced tau hyperphosphorylation ABSTRACT: Objective To investigate the in vivo effect of melatonin (Mel) on calyculin A(CA)induced tau hyperphosphorylation in neuroblastoma cells (N2aol/L Mel, detected the level of tau phosphorylation munofluorescence, and assayed the activities of GSK3 and the ratio of GSK3β phosphorylated at Ser9 site to total GSK3β. Results CA treatment led to tau hyperphosphorylation acpanied ultaneously ol/L Mel, the CAinduced tau hyperphosphorylation, GSK3 activation and the ratio of GSK3β phosphorylated at Ser9 site to total GSK3β decrease a cells from CAinduced tau hyperphosphorylation. Its protection may be related to the regulation of GSK3 activity and the ratio of GSK3β phosphorylated at Ser9 site to total GSK3β increase. KEY el)处理，则可对抗CA引起的上述变化3。糖原合酶激酶3(GSK3)是可使tau的多个位点发生磷酸化的蛋白激酶4。根据报道GSK3激活参与氧化应激诱导的tau蛋白磷酸化5，而另据报道，CA可引起氧化应激6，因此，我们推测CA处理诱导神经细丝磷酸化可能也与GSK3激活有关，而抗氧化剂褪黑素也可能调节GSK3活性。为此，我们分别用CA处理、Mel和CA同时处理N2aa公司产品；过硫酸铵(AP)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自美国Pierce公司；硝酸纤维素膜(NC膜)为 Hybond公司产品；单克隆抗体PHF1(识别Ser396/404位点磷酸化的tau，1∶300)、Tau1(识别非磷酸化的tau，1∶500)、多克隆抗体111e(识别总tau，1∶500)购自Sternberger公司；大鼠多克隆抗体GSK3((1∶1000)、大鼠多克隆第9位丝氨酸磷酸化的GSK3(抗体(1∶1000)购自Cell Signaling公司。所用抗体稀释液为50g/L脱脂奶粉，TBS/T配制；荧光素异硫氰酸盐标记羊抗鼠、羊抗兔IgG抗体购自美国Sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体和ECL显色系统购自美国Santa Cruz公司；CA购自美国Biochemical公司；γ32PATP购自北京亚辉生物医药公司。 1.2 细胞培养 鼠野生型成神经瘤细胞贴壁生长细胞株(N2a Institute, La Jolla, California, USA)提供，细胞用含50mL/L FBS的DMEM/OptiMEM(1∶1)培养基，在5%(体积分数)CO2、37℃培养箱内进行培养，每2-3d更换培养液一次，细胞达70%-80%丰度时，传代或用于实验。给药处理前，细胞用无血清培养基培养12h诱导分化。细胞分为3组：正常对照组，加入含DMSO( 0.01%体积分数)的培养基；CA组，加入5nmol/L CA；Mel组，同时加入5nmol/L CA 50μmol/L Mel。 1.3 间接免疫荧光染色 细胞以5×105/孔的密度接种在24孔板中，孵育24-36h，待细胞生长达70%丰度时，去血清培养12h；按上述分组给药处理12h后，细胞用冷PBS洗2次，用40g/L多聚甲醛室温固