PCR技术介绍2剖析.ppt

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PCR技术介绍2剖析

很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一 Kary B. Mullis (1944 -),在Cetus公司工作期间,发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作, 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上,他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物(而不是一个引物)去扩增模板DNA 的想法…... PCR的发展史 1983年春,Mullis发展出PCR的概念; 1983年9月,Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验,只用一个循环; 1983年12月,用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断; 1985年12月20日,Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文,方法中用了PCR技术,导致Mullis的文章到处被拒; 1985年10月25日申请了PCR的专利,1987年7月28日批准(专利号4,683,202 ),这回Mullis是第一发明人。 1986年5月,Mullis在冷泉港实验室做专题报告,全世界从此开始学习PCR的方法; 1986年6月,Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶,Taq DNA polymerase,这是85年春天Mullis建议做的; 1988年,第一台PCR仪问世; 1991年,Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。 PCR不只是一个方法改进 Mullis的上司有句“名言”,“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”; 到了1991,Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司,并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红; Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖,PCR和DNA重组技术一样意义深远。 PCR扩增产物的分析法 1.凝胶电泳分析法 2.点杂交法 3.微孔板夹心杂交法 4. PCR-ELISA法 5. . TaqMan荧光探针技术 定量 PCR,TaqMan体系 ABI 公司首先推出(PRISM 7000系列) US Patent 5,723,591, 1995年11月申请。 实时检测: 每个循环都会产生与PCR产物成正比的荧光物质 X区(核苷酸1,374~1,835)可能编码有154个氨基酸的碱性多肽,长链的裂口位于此区。 X区 HBV DNA定量检测的意义 判断肝病的病情、预后和传染性 预测抗病毒治疗的效果 监测和评价抗病毒药物的疗效 对于持续性感染的病毒性肝炎,病毒血症水平的消长与肝脏损害情况和预后相关。 随着病毒感染后肝脏病理损害的进展,病毒核酸逐渐在宿主血液中积蓄,直到发展为肝病晚期时,病毒血症也达到了最高水平,故如果病毒核酸水平升高表示病恶化,预后不良;水平降低说明向好的方向发展。 血中HBV核酸定量水平的高低,也是衡量传染性强弱的最直接量化指标。 判断肝病的病情、预后和传染性 血中病毒水平,对抗病毒药物的治疗效果,有预报的作用。 病毒水平降低,治疗效果好; 病毒水平升高,治疗效果差。 预测抗病毒治疗的效果 应用抗病毒药物(如干扰素、拉米呋啶等)治疗前和治疗过程中,应定量检测血中病毒水平,以判断病人对药物的应答情况,修正治疗方案和评价疗效。 监测和评价抗病毒药物的疗效 YMDD突变株 YMDD: 酪氨酸蛋氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸 YIDD 突变:蛋氨酸 亮氨酸 YVDD突变:蛋氨酸 缬氨酸 基 因 芯 片 技 术 平 台 DNA芯片技术 以玻璃、硅片作为载体 以膜片作为载体 PCR技术 荧光定量PCR PCR 基因芯片的基本构造 探针 支持物 外观 剖面图 平面局部放大 DNA芯片的组成: 1: 支持物:如玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜 2: 探针:高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上,每个位点的序列是已知的 基因芯片原理 采集标本 提取基因组 DNA/RNA PCR/RT-PCR 扩增 探针杂交 显色/扫描 电泳检测 玻璃片 膜 片 电泳图 DNA样品的获取和目的片段的PCR扩增 扩增区域 Biotin Primer down Primer up Biotin PCR扩增和目的片段的标记 人乳头瘤病毒分型基因检测芯片 人乳头瘤病毒(Human Papillomaviruses, HPV) 双链DNA无包膜病毒 环状DNA,约8Kb 病毒颗粒直径为50~55nm。 依靠宿主细胞进行复制、转录和翻译。 广泛分布在高等脊椎动物 有很高的种属特异性 定向感染皮肤及粘膜的复层鳞状上皮 型别与分布 已发现100多种不同的亚型,其中超过40种可以感染人类的生殖器官

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