PCR技术介绍2剖析.ppt

很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖， Mullis是其中之一 Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法…... PCR的发展史 1983年春，Mullis发展出PCR的概念； 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环； 1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法； 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的； 1988年，第一台PCR仪问世； 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。 PCR不只是一个方法改进 Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”； 到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红； Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。 PCR扩增产物的分析法 1.凝胶电泳分析法 2.点杂交法 3.微孔板夹心杂交法 4. PCR-ELISA法 5. . TaqMan荧光探针技术 定量 PCR，TaqMan体系 ABI 公司首先推出(PRISM 7000系列) US Patent 5,723,591, 1995年11月申请。 实时检测: 每个循环都会产生与PCR产物成正比的荧光物质 X区（核苷酸1，374～1，835）可能编码有154个氨基酸的碱性多肽，长链的裂口位于此区。 X区 HBV DNA定量检测的意义 判断肝病的病情、预后和传染性 预测抗病毒治疗的效果 监测和评价抗病毒药物的疗效 对于持续性感染的病毒性肝炎，病毒血症水平的消长与肝脏损害情况和预后相关。 随着病毒感染后肝脏病理损害的进展，病毒核酸逐渐在宿主血液中积蓄，直到发展为肝病晚期时，病毒血症也达到了最高水平，故如果病毒核酸水平升高表示病恶化，预后不良；水平降低说明向好的方向发展。 血中HBV核酸定量水平的高低，也是衡量传染性强弱的最直接量化指标。 判断肝病的病情、预后和传染性 血中病毒水平，对抗病毒药物的治疗效果，有预报的作用。 病毒水平降低，治疗效果好； 病毒水平升高，治疗效果差。 预测抗病毒治疗的效果 应用抗病毒药物（如干扰素、拉米呋啶等）治疗前和治疗过程中，应定量检测血中病毒水平，以判断病人对药物的应答情况，修正治疗方案和评价疗效。 监测和评价抗病毒药物的疗效 YMDD突变株 YMDD: 酪氨酸蛋氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸 YIDD 突变：蛋氨酸 亮氨酸 YVDD突变：蛋氨酸 缬氨酸 基 因 芯 片 技 术 平 台 DNA芯片技术 以玻璃、硅片作为载体 以膜片作为载体 PCR技术 荧光定量PCR PCR 基因芯片的基本构造 探针 支持物 外观 剖面图 平面局部放大 DNA芯片的组成： 1: 支持物：如玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜 2: 探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是已知的 基因芯片原理 采集标本 提取基因组 DNA/RNA PCR/RT-PCR 扩增 探针杂交 显色/扫描 电泳检测 玻璃片 膜 片 电泳图 DNA样品的获取和目的片段的PCR扩增 扩增区域 Biotin Primer down Primer up Biotin PCR扩增和目的片段的标记 人乳头瘤病毒分型基因检测芯片 人乳头瘤病毒（Human Papillomaviruses, HPV） 双链DNA无包膜病毒 环状DNA，约8Kb 病毒颗粒直径为50～55nm。 依靠宿主细胞进行复制、转录和翻译。 广泛分布在高等脊椎动物 有很高的种属特异性 定向感染皮肤及粘膜的复层鳞状上皮 型别与分布 已发现100多种不同的亚型，其中超过40种可以感染人类的生殖器官