转41BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗刺激脾细胞产生细胞因子的研究论文.docVIP

　　转41BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗刺激脾细胞产生细胞因子的研究论文 刘承利, 臧晓霞, 窦科峰, 朱帮福, 张洪义, 张宏义 【摘要】 目的 研究转41BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗体外刺激同系小鼠脾细胞产生细胞因子（IL2、TNFα和GMCSF）的能力。方法 以丝裂霉素C（MMC）处理高表达转m41BBL基因的小鼠Hepa16肝癌细胞，制成肿瘤细胞瘤苗（TCV），体外与同系小鼠脾淋巴细胞共同培养后，观察其对脾细胞产生细胞因子（IL2、TNFα和GMCSF）的影响。结果 TCV41BBL刺激后，脾细胞体外分泌细胞因子IL2、TNFα和GMCSF的水平明显增高。结论 转41BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗能刺激脾细胞产生细胞因子IL2、TNFα和GMCSF。 【关键词】 小鼠41BBL; 共刺激分子; 肿瘤疫苗; 肝细胞癌; 细胞因子 Abstract：Objective To study the cytokines production of spleen cells induced in vitro by murine 41BBL gene transfected Hepa16.Methods Murine hepatocellular carcinoma cell line Hepa16m41BBL urine 41BBL or cell vaccine (TCVm41BBL) 41BBL itomycin (MMC). Cocultivation TCV urine spleen cells and the supernatants ulated by TCVm41BBL.Conclusion Stimulation signals delivered by 4BBL remarkably increased the production of IL2,TNFα and GMCSF. Key urine 41BBL; Costimulatory molecule; Tumor cell vaccine; Hepatocellular carcinoma; Cytokines 0 引言 机体对肿瘤的免疫主要靠细胞免疫，特别是T细胞免疫。而T细胞的激活除了MHC抗原多肽复合物与T细胞受体（TCR）的结合所提供的第一信号外，共刺激分子（Costimulatory molecules）提供的第二信号也起着至关重要的作用 1。缺乏这些共刺激分子将导致T细胞进入克隆无能或凋亡。因此，将共刺激分子导入肿瘤细胞以制备肿瘤疫苗成为近来肿瘤生物治疗的研究热点。我们在研究中发现将小鼠肝癌细胞Hepa16中导入41BBL基因能明显增强其体内诱导机体产生免疫应答的能力 2.freel41BBL基因的高表达细胞株Hepa16m41BBL及转空载体的Hepa16neo为作者建立［3］，DMEM培养基为Gibco公司产品，新生牛血清为杭州四季青公司产品。大鼠抗小鼠41BBL抗体（BD公司产品）购自深圳晶美公司，羊抗大鼠IgGFITC、PHAP、MTT、DMSO为Sigma公司产品。丝裂霉素C（MMC）为 Kyo41BBL基因全长序列设计上游引物P1：5’GCGGATCCATGGACCAGCACACACTTGA3，下游引物P2：5’CGGATTCTCATTCCCATGGGTTGTCGG3’。预计扩增片段长度为945bp。 1.2 方法 1.2.1 肿瘤细胞疫苗的制备 收集培养的Hepa16、Hepa16neo及Hepa16m41BBL细胞，1×PBS液洗2次，细胞数调至1×1010/L，用MMC（80mg/L）于37℃、50%CO2处理1h，1×PBS液洗3次，重悬细胞，制成肿瘤细胞疫苗备用 (分别称为TCVHepa16、TCVHepa16neo、TCVm41BBL)。 1.2.2 MMC处理前后转染细胞m41BBL表达的变化 取对数生长期的Hepa16m41BBL细胞稳定表达克隆，以1×105 /孔的浓度铺6孔板，培养48h后，1×PBS洗2次，用MMC（80mg/L）于37℃、50% CO2处理1h，1×PBS洗3次，重新加完全培养液培养，分别于作用前、作用后6h、24h、48h收集细胞提取总RNA，用于RTPCR检测。 1.2.3 C57BL/6小鼠脾细胞悬液制备及混合淋巴细胞培养 无菌取C57BL/6小鼠脾脏，无菌玻璃针芯研磨并过150目筛网，制备单细胞悬液， RPMI1640洗涤一次，以含10%新生牛血清的RPMI1640重悬细胞，调整细胞浓度为1×107/ml，置 12孔培