3 动物细胞的大规模培养.pptVIP

原 理 是将对细胞无害的颗粒——微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。 贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。相融性与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理pH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。 （三）微载体培养原理与操作 五、微载体培养技术 返回 影 响 因 素 搅拌转速：由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。 影响细胞在微载体表面生长的因素很多，主要有三个方面： （1）在细胞方面，如细胞群体、状态和类型。 （2）在微载体方面，如微载体表面状态、吸附的大分子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。 （3）在培养环境中，如培养基组成、温度、pH以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。 （三）微载体培养原理与操作 五、微载体培养技术 微载体培养操作要点 （1）培养初期：保证培养基与微球体处于稳定的pH与温度水平，接种细胞至终体积1/3的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。不同的微载体所用浓度及接种细胞密度是不同的。 （2）贴壁阶段（3～8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。 （3）培养维持期：进行细胞计数葡萄糖测定及细胞形态镜检。随着细胞增殖，微球会变得越来越重，需增加搅拌速率。 （4）收获细胞：首先排干培养液，至少用缓冲液漂洗1遍，然后加入相应的酶，搅拌。然后解离收集细胞及其产品。 （5）微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。使用异倍体或原代细胞可培养生产疫苗、干扰素。 （三）微载体培养原理与操作 五、微载体培养技术 概 述 微载体大规模细胞培养技术中细胞扩增的效率受到诸多因素的影响和限制，其中主要的限制性因素包括：细胞对剪切力的敏感性、氧的传递以及传代和扩大培养等。而研制的各种类型生物反应器系统则可针对上述限制性因素，为微载体细胞培养与扩增提供低剪切力、高氧传递效率、易于细胞传代等适宜的外部环境。已较多使用的微载体培养系统生物反应器，可以实行计算机控制操作，培养搅拌速度及悬浮均匀程度、温度变化、pH稳定及溶氧供应（O2、N2、CO2、空气四种纯化气体按比例调节）、罐压、培养体积和通气量等参数全部由电脑自动控制。 （四）微载体大规模细胞培养的生物反应器系统 五、微载体培养技术 返回 概 述 应用生物反应器系统进行微载体细胞大规模扩增具有明显优势，目前国外相继研制了数种适合进行微载体大规模细胞培养的生物反应器系统，如搅拌式生物反应器系统、旋转式生物反应器系统以及灌注式生物反应器系统等。 （四）微载体大规模细胞培养的生物反应器系统 五、微载体培养技术 （四）微载体大规模细胞培养的生物反应器系统 五、微载体培养技术 微载体培养设备 常见反应器系统 1．搅拌式生物反应器系统 在微载体细胞大规模扩增研究领域已有较长的研究历史，但因该细胞培养系统容易产生过大剪切力，从而限制了应用范围。 2．灌注式生物反应器系统 目前研究热点之一。特点是不断加入新鲜培养基以及不断抽走含废物的消耗培养基，使生长环境相对稳定，既省时省力，又减少了细胞发生污染的机会，且可以提高细胞密度10倍以上。 3．旋转生物反应器 近年来，旋转生物反应器系统已经成为应用微载体技术进行细胞大规模扩增的一种较常用细胞培养系统。该系统是基于美国航空航天局为模拟空间微重力效应而设计的一种生物反应器。 （四）微载体大规模细胞培养的生物反应器系统 五、微载体培养技术 微载体培养优点 （1）表面积/体积（S/V）大，因此单位体积培养液的细胞产率高； （2）把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点； （3）可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况； （4）简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好； （5）培养基利用率较高； （6）放大容易； （7）细胞收获过程不复杂； （8）劳动强度小； （9）培养系统占地面积和空间小。 （五）微载体培养优点 五、微载体培养技术 返回 教 学 小结 动物细胞培养开始