DNA-现代生物学实验室.PDF

基因工程实验 (Gene Engineering) 实 验 内 容  基因工程实验的基本知识简介  实验规范训练、实验准备  PCR基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测  扩增产物的回收(核酸的回收)  DNA重组－酶切连接  大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化筛选  质粒DNA的提取 基因工程实验的基本知识简介  基因工程又称DNA重组技术  外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内，使这个基因 能够在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的操作  包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞内的保持、 转录、翻译表达等全过程  基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、受体细胞 量程的选择－移液器 实验规范训练－标签 1. 所用的器皿上一定要做标记 2. 标签一定要贴到固定的位置 3. 标签上应包括具体的名称、组别、实验班、日期 实 验 规 范－实验操作 1. 详细记录和分析实验结果并按时提交实验报告 2. 实验中一定要处处用心、勤动手，多问为什么 3. 仔细操作和观察 4. 保留好每一步的实验样品，在确准的情况下才能当废液扔掉 基因克隆简要流程： 1.染色体DNA提取 2.PCR扩增目的基因 3. 回收目的基因、连接、转化（克隆载体） 4. 重组子筛选和质粒鉴定 5.酶切回收目的基因、连接、转化、鉴定（表达载体） 6.诱导表达 7.SDS检测 8. 目的基因表达产物回收 基因克隆详细流程： 1. PCR扩增目的基因、电泳检测、大量扩增、目的片段回收、电泳检测 2. 目的片段和T载体连接过夜、DH5α感受态制备（用于克隆T载体） 3 . 转化、过夜培养、重组子筛选（蓝白斑、抗生素） 4. 质粒提取、电泳检测、鉴定（酶切、PCR ）、电泳检测 5. 大量酶切回收目的片段、电泳检测 酶切回收表达载体（PET ） 6. 目的基因和表达载体连接过夜、BL21感受态制备（用于克隆表达载体） 7 . 转化、过夜培养、重组子筛选（抗生素） 8. 质粒提取、电泳检测、鉴定（酶切、PCR ）、电泳检测 9. 培养诱导表达（IPTG ）、菌体回收、点样品制备 10. SDS、染色 11. 表达产物回收 基因克隆详细流程 1. PCR扩增目的基因、电泳检测、目的片段回收、电泳检测 2. 目的片段和T载体连接、DH5α感受态制备（用于克隆T载体） 3 转化、过夜培养、重组子筛选（蓝白斑、抗生素） 4. 质粒提取、电泳检测、鉴定（酶切、PCR ）、电泳检测 实验一 PCR扩增目的基因 【实验目的】 • PCR: 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction） • 掌握PCR反应的基本原理与实验技术 • 了解PCR的应用范围 • 获取目地基因actin 复习 体内DNA的复制 5’ 3’ 3’ 5’ 解旋酶类 DNA聚合酶 dNTP RNA 引物 DNA的变性和复性 变 加热或强酸、碱性作用可以使 加热 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解 性 离,形成单链DNA,这称为DNA的 变性。 复 解除变性