人剪切修复基因XPD对人HepG2肝癌细胞中Rb和MAD2表达的影响.pdfVIP

摘要 摘 要 目的： 研究人类剪切修复基因XPD （Xeroderma pigmentosum D)转染至人HepG2 肝癌细胞后 Rb(Retinoblastoma gene,视网膜母细胞瘤基因) 和 MAD2 （Mitotic arrest deficient 2,有丝分裂阻滞缺陷蛋白2 ）基因表达的变化及对HepG2 肝癌细 胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。 方法： 1、培养人HepG2 肝癌细胞，细胞生长稳定后,传代并接种于6cm 培养皿中 继续培养。 2 、将我实验室构建与合成的pEGFP-N2-XPD 重组质粒和pEGFP-N2 空载质 粒，应用Lipofectamine™2000 将前两者瞬时转染至人HepG2 肝癌细胞中。实验 分为4 组，分别是无转染的HepG2 肝癌细胞空白对照组 （空白对照组）脂质体 转染HepG2 肝癌细胞组（脂质体组）空载质粒转染细胞HepG2-pEGFP-N2 组（N2 组）重组质粒转染细胞HepG2-pEGFP-N2-XPD 组 （XPD 组） 3、转染后，提取各组RNA，用RT-PCR 检测各组细胞的XPD 、Rb 及MAD2 的mRNA 表达量 4 、转染后提取各组的总蛋白，通过Western blotting 法检测各组细胞中XPD 、 Rb 及MAD2 蛋白质的表达量。 5、将细胞接种于96 孔板，进行转染后，通过MTT 检测各组细胞的增值活 力。 6、用流式细胞仪检测各组的细胞凋亡情况及细胞周期。 结果： 1、转染至人HepG2 细胞24h 后，在荧光显微镜下观察，发现XPD 组和N2 组细胞中都有绿色荧光蛋白的表达，绿色荧光覆盖率 75% 以上，而未转染的 HepG2 细胞不表达绿色荧光。 2 、RT-PCR 检测各组各基因mRNA 表达量，较其他3 组，XPD 组中XPD 和Rb 的表达量明显升高 （P 0.05 ），而MAD2 的表达量明显下降 （P 0.05 ）。 3、Western blotting 检测各组各基因蛋白的表达量，较其他3 组，XPD 组中 II 万方数据 摘要 XPD 和Rb 的表达量明显升高（P 0.05 ），而MAD2 的表达量明显下降（P 0.05 ）。 4 、MTT 结果显示，XPD 组的HepG2 肝癌细胞增值活力明显降低。 5、流式细胞仪检测凋亡结果显示，XPD 组细胞凋亡率明显升高 （P 0.05 ） 6、流式细胞仪检测各组细胞周期结果显示，XPD 组的G1 期细胞数明显多 于其他三组，S 期细胞数较其他三组明显减少，差异有统计学意义 （均P0.05 ）， 空白对照组、脂质体组及 N2 组细胞之间 G1 期和 S 期差异无统计学意义 （均 P0.05 ），说明XPD 组的细胞停滞在G1 期，难以进入S 期。 结论： XPD 基因能抑制MAD2 基因的表达，促进Rb 基因的表达，XPD 能抑制肝 癌细胞的增殖，促进肝癌细胞的凋亡。 关键词：肝癌；XPD ；Rb ；MAD2 ；细胞增殖；细胞凋亡 III 万方数据 Abstract ABSTRACT