肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中的表达及应用研究.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（１１）：６５６９ ? 肺炎支原体Ｐ１蛋白羧基端基因片段在 大肠杆菌中的表达及应用研究 １ ２ ２ ２ 黄劲松 　黄捷勤 　唐启慧 　陈禹保 （１北京市科学技术研究院科技处　北京　１０００９４　２北京标凯科技有限公司　北京　１０００９４） 摘要　目的：克隆、表达和鉴定肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＭＰ）Ｐ１蛋白羧基端基因序列， 为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆肺炎支原体Ｐ１蛋白羧基端基因片段并 测序的基础上，将基因序列克隆到表达载体ｐＥＴ３２ａ（＋）上，构建了重组表达质粒ｐＥＴ３２ａ（＋）／ ２＋ Ｐ１（３５２０～４５６３ｂｐ），转化大肠杆ｒｏｓｅｔｔａ，ＩＰＴＧ诱导表达，利用Ｎｉ亲和层析柱对重组蛋白进行纯 化，并用ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ方法检测其抗原性。重组蛋白免疫小鼠，制备单克隆抗体。结 果 重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达，ＳＤＳＰＡＧＥ显示其相对分子质量与预计大小一致，蛋白 质纯度达９５％以上。ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ实验证实，重组蛋白具有良好的抗原性。并成功获 得两株高效价单克隆抗体。结论：本研究成功克隆和表达了肺炎支原体Ｐ１蛋白羧基端基因序 列，制备了抗肺炎支原体Ｐ１蛋白单克隆抗体，为肺炎支原体诊断试剂和疫苗的开发等进一步的 研究奠定了基础。 关键词　肺炎支原体　Ｐ１蛋白　克隆表达　单克隆抗体 中图分类号　Ｑ７８ 　　肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＭＰ）属于原 尖端样结构、特殊的吸附细胞器完成的。多种蛋白参 生生物门、柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属。 ［３］ 与吸附细胞器的黏附过程。Ｈｕ等 在 １９７７年发现了 ＭＰ是引起人类非典型肺炎和许多呼吸道感染的病原 一个位于肺炎支原体表面的１６９ｋＤａ的蛋白，命名为 体之一，感染后还会导致心肌损害、神经系统损害、肾 ［４］ Ｐ１，后来发现此蛋白与宿主受体结合有关 。研究显 脏损害、传染性单核细胞增多症和川崎病等并发症。 示，Ｐ１黏附蛋白是ＭＰ的主要黏附蛋白，位于附植细胞 并且ＭＰ对青霉素类药物不敏感，但对大环内酯类、四 器（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔｏｒｇａｎｅｌｌｅ）顶端的表面，含有多个抗原决 ［１２］ 环素类药物敏感 。近年来 ＭＰ感染有增多趋势，临 ［５］ 定簇 。是主要的免疫原，Ｐ１黏附蛋白或其亚单位可 床合并症复杂。 ［６９］ 作为ＭＰ基因工程疫苗和诊断试剂盒的候选蛋白 。 　　ＭＰ的致病机理尚未完全清楚，临床尚缺乏特异、 因为Ｐ１黏附蛋白与生殖道支原体 １４０ｋＤａ蛋白之间存 敏感、快速的诊断方法。同时研究显示，免疫接种可预 在共同抗原决定簇，与真核生物结构蛋白也存在一定 防ＭＰ的感染，而目前国内外有关 ＭＰ灭活疫苗、减毒 同源性，所以用完