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多维液相色谱分离技术在复杂蛋白质组学样品鉴定中的应用 作者：张罗敷 胡晓芳 徐学敏（上海交通大学 上海 200030） 期刊： 现代生物医学进展 Progress in Modern Biomedicine Vol.13 NO.1 JAN.2013 一 目的 在蛋白质组学研究中，无论是以分析生物体内尽可能多的蛋白质组成情况的 竭泽法 研究策略，还是以分析不同时期细胞内蛋白质组成变化的 功能法 研究策略，若要良好的实现研究目标，很大程度上取决于是否有强大的样品分离和鉴手段，对蛋白质组样本进行深入的分析。生物体内蛋白质组的复杂性很高，其动态范围达到 1010，而质谱检测范围具有一定的限制性。对于复杂的蛋白组学样品，在进入质谱检测之前进行有效的分离是提高质谱检测效率的关键。经典的蛋白质组学样品分离手段是二维凝胶电泳（2D-E），蛋白质混合物先后按照等电点差异和分子量差异，在凝胶上分离和富集，这种方法能分析数千个蛋白质，在蛋白质组学研究中发挥过重大作用。但是，由于基于二维凝胶电泳的蛋白质分离和鉴定技术耗费人力，并且在高分子量蛋白、低分子量蛋白、极碱性蛋白和疏水性蛋白检测方面有限制。近年来，随着蛋白组学技术的发展，液相色谱 - 串联质谱的联用技术（液质联用）逐渐成为蛋白组学的主流技术。高效液相色谱 （high performance liquid chro-matography，HPLC）由于其高自动化、高重现性以及高分离效率，成为蛋白和肽段分离的重要方法，而且通过与质谱联用，能够形成高自动化的分离和鉴定系统。在基于液质联用的蛋白质组学工作方法中，常使用 鸟枪法（shotgun strategy），即蛋白质混合物通过酶解后生成的肽段混合物进行色谱分离，并将洗脱的肽段连续地输送到质谱中检测。 现在人们普遍认为，由于从实际生物学样本中提取的蛋白质组学样品复杂性很高，仅通过一维色谱分离无法对其达到满意的分离效果，多维液相色谱分离技术由此应运而生。 多维液相色谱 （multi-dimensional liquid chromatography，MDLC）是指通过不同分离原理的液相色谱的串联使用，提高分离系统的峰容量和分辨率，从而实现复杂样品充分分离的一种技术。根据 Giddings 等建立的数学模型，在理想的多维液相色谱分离系统中，每一维分离都应该是正交的，即具有相互独立的分离原理。此时多维液相色谱系统的总峰容量（n）等于系统中每一维分离的峰容量（ni）的乘积，即 n=n1×n2×n3……。因此，恰当使用各种分离模式，可以使单维的色谱分离效果得到最大的发挥，组合形成的多维色谱分离系统可以大幅度地提高分离系统的峰容量和分离能力，充分解析复杂程度较高的样品。在本文中，我们介绍了在蛋白质组学研究中用到的多种多维液相色谱分离系统。在这些系统中，为了使样品得到充足的分离，多种不同的分离原理 HPLC 方法被灵活地结合运用。充分利用样品分子的各种理化特性，在每一个分离维度上都尽量达到较好的分离效果，在整体上有效降低了样品的复杂程度。同时，在不断追求深入而全面的蛋白鉴定的同时，多维液相色谱分离系统的维数也有所提高，出现了二维、三维甚至更高分离维数的系统。 二 做了什么 1 二维液相色谱分离系统 为了有效的分离在鸟枪法分析方法中产生的复杂肽段混合物，二维液相色谱分离系统 （two dimensional liquid chro-matography，2DLC）结合了两种原理不同的 HPLC 类型，先后对肽段混合物进行 2 次分离。最常用的 2DLC 是离子交换色谱- 反相色谱的二维串联。1999 年，J. Yates 实验室首次提出了将强阳离子交换（strong cation exchange，SCX）色谱 - 反相色谱这一二维分离系统和质谱连接，后来称为多维蛋白鉴定技术（multi-dimensional protein identification technology，Mud PIT）的高自动化分析方法。在这一方法中，通过一根前后两段分别装有 SCX 和 PR 填料的双相毛细管柱构建了在线 SCX-RP 分离系统。在这一方法中的两维分离有着良好的正交性，肽段混合物在第一维 SCX 中通过增加的盐浓度梯度台阶，按照其带电状态分离，在第二维 RP 中按照疏水性质分离，利用两种不同的色谱分离机制，将在第一维色谱中分离程度较低的肽段继续在第二维色谱中进一步分离。而且，这一系统中双相柱的使用，避免了阀切换系统和管路系统的死体积影响，在一定程度上提高了 2DLC 的分离效率。该系统在 2001 年的研究中被应用于酵母细胞裂解液的蛋白质组检测中，在一次实验中能鉴定到 1484 个蛋白，蛋白性质分析发现这些鉴定到的蛋白涵盖较大的丰度和各种理化性质。为了进一步