蛋白质的体外合成和纯化作业.docVIP

蛋白质的体外合成和纯化 一、蛋白质体外合成方法概述 无细胞蛋白质合成系统（The cell-free protein synthesis system）是一种以外源mRNA或DNA为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。与传统的体内重组表达系统相比，体外无细胞合成系统具有多种优点，如可表达对细胞有毒害作用或含有非天然氨基酸（如D-氨基酸）的特殊蛋白质，能够直接以PCR产物作为模板同时平行合成多种蛋白质，开展高通量药物筛选和蛋白质组学的研究。 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为：分、切、连、转、选。其中，“分”是指分离制备合格的待进一步操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出的目的基因；“连”是指用DNA连接酶，将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。最终目的在于通过相应技术手段，将目的基因导入寄主细胞，在宿主细胞内的目的基因被大量的复制。 基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 二、基因克隆方法操作步骤 1、目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步，基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段。所需目的基因的来源，不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选。 2、重组质粒的构建 DNA体外重组是将目的基因在DNA连接酶作用下，连接到合适的载体DNA上，以便下一步转化之用。这种由两种不同DNA片段重新组合而成的DNA称重组DNA，简称重组体。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有镁离子、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。 DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA?连接酶催化DNA连接反应分为三步：首先，T4?DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。 很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12～16℃，连接12～16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 3、重组分子的扩增和鉴定 3.1 重组DNA分子导入受体细胞 目的基因和载体在体外连接形成重组DNA分子后，需要被导入受体细胞中才能进行增殖和（或）表达。接受重组DNA分子的细胞称作受体细胞或宿主细胞。受体细胞分为原核细胞（如大肠杆菌）和真核细胞（如酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞）。原核细胞可作为基因复制扩增的场所，也可作为基因表达的场所；而真核细胞一般只用作基因表达系统。 受体细胞是重组基因增殖的场所，所以对受体细胞也应具有几点要求：①容易接纳重组DNA分子；②对载体的复制扩增无严格限制；③不存在特异的能降解外源DNA的内切酶体；④不对外源DNA进行修饰。由于载体的不同，所具备的筛选标志不同，所用的受体细胞也不同，因此可根据所用的载体选择合适的受体细胞。一般将重组DNA分子导入原核细胞的过程称为转化，而导入真核细胞的过程称为转染。未经处理的大肠杆菌很难接受外源重组DNA分子，但经物理或化学方法处理后，细菌对摄取外来DNA分子变得敏感了，这种经处理而易接受外源DNA分子的细胞叫做感受态细胞。将重组DNA分子和感受态大肠杆菌细胞相混合，使重组DNA分子进入