第十三章基因工程.ppt

第十三章 病毒基因工程 第一节 病毒载体 第二节 基因工程病毒疫苗 第三节 病毒与基因治疗 第四节 病毒与生物防治 第一节 病毒载体 病毒载体作为基因转移和表达载体的特点： (1) 具有能够被宿主细胞识别的有效启动子； (2)在感染周期中能持续复制； (3)有些病毒具有控制复制的顺式和反式作用因 子，能在胞内使外源基因长期高拷贝复制； (4)能高效整合到宿主基因组，可提高外源基因整 合到宿主细胞染色体的效率； (5)病毒衣壳蛋白能够识别细胞接受器，可将外源 基因高效导入寄主细胞。 一、动物病毒载体 1、SV40载体 SV40病毒基因组是环状双链DNA，大小仅为5243bp，与质粒大小相似，适于基因操作。 SV40在感染敏感宿主细胞后，其基因组DNA进入细胞核，首先启动早期基因转录，在细胞质中表达出早期基因t抗原和T抗原，当这2种蛋白质积累到一定程度时DNA开始复制，同时开始驱动病毒晚期基因转录，翻译产生VP1、VP2和VP3等病毒衣壳蛋白，并开始进行病毒粒子的装配。当病毒粒子数量积累到一定量时，细胞裂解释放出子代病毒粒子。 ● SV40病毒不能携带大于本身基因组的DNA分子，因此，外源基因只能通过取代病毒本身的DNA片段进行克隆。 ● 以SV40病毒为基础的克隆载体主要有2种不同类型： （1）置换型重组病毒载体 外源DNA插入缺陷性的病毒基因组中。 根据置换位置不同分为： ①早期置换型 ②晚期置换型 （2）重组的病毒-质粒载体 载体只保留复制序列，无衣壳蛋白，不能产生病毒粒子，但可进行复制并产生很多拷贝，所以依然可以高水平表达外源基因。 2、痘苗病毒载体 属于感染哺乳动物细胞的双链线性DNA病毒，基因组在180kb左右，其中30kb左右为非必需区，可以被外源DNA片段取代而不影响复制与增殖。 特点： * 容易培养，相当稳定，能在大多数哺乳动物细胞 中复制繁殖。 * 由于其基因组很大，因此只能先将目的基因克隆 到转移载体上，然后将充足转移载体与野生性痘 苗病毒DNA共转染哺乳动物细胞，在细胞内发 生同源重组而获得重组痘苗病毒。 * 高效，能同时预防几种病原物引起的传染病。 3、反转录病毒载体 为单链RNA病毒，可高效感染许多宿主细胞。 病毒进入细胞后，其基因组RNA反转录成双链DNA，DNA进入宿主细胞核并整合在染色体上，且以此为模板合成病毒蛋白及子代基因组RNA，然后装配成病毒颗粒。 反转录基因组含3个最重要的基因: gag (编码核心蛋白) pol (编码转录酶) env (编码病毒外膜蛋白) 依次由5’向3’方向排列。Env基因中含有病毒包装 所必须的序列 两端存在长末端重复区（LTR），用于介导病毒的整合。 4、腺病毒载体 其基因组为线状双链DNA。能广泛感染各种分化或未分化的哺乳动物细胞。基因组长36kb，两段各有一个反向末段重复序列(ITR)，ITR内侧为病毒包装信号。 基因组上分布着4个承担调节功能的早期基因→E1、 E2、E3、E4和1个编码结构蛋白的晚期基因 缺点: 能诱导机体产生免疫反应，并存在安全性问题。 通过改造，目前腺病毒载体已经被广泛用于蛋白质 表达、RNA干扰、基因治疗载体、肿瘤治疗和疫苗的 研制等。 5、单纯疱疹病毒载体(HSV) 中等大小的双链DNA病毒，有囊膜，外形呈二十面体对称，直径120-200nm 优点： ①基因组庞大，并已完成全序列测定，只用于大范围基因操作，可插入30kb以上的外源DNA。 ②可感染脊椎动物多种类型的细胞，具有嗜神经性，为目前唯一适合于神经细胞的病毒载体。 ③在神经元内能进入潜伏状态，部分基因可保持转录活性而不影响神经元的正常功能。 HSV载体分为两大类: ①重组质粒型载体 优点：构建过程相对简单 缺点：重组质粒DNA携带外源基因的容量有限，而且包装效率不如病毒 DNA ②重组病毒型载体 直接利用经改造的病毒基因组作为载体。 优点：在神经元内能真正进入潜伏状态，能携带多个外源基因，无须辅助病毒，传递效率相当高。 缺点：病毒基因组内的毒性元件