2015春 第八章 酶的定向进化 to students概要1.ppt

Chapter 8  Enzymatic Directed Evolution 第八章 酶的定向进化 微生物发酵产酶(Chap. 2) 定向进化（directed evolution） 自然进化 酶的定向进化 理性设计rational design 酶的定向进化 酶定向进化概念 酶定向进化是模拟自然进化过程，在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术。 属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制。 澄清一个事实：定向进化不是定点突变 定向进化：突变 筛选 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。 定点突变： 突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。 酶定向进化的基本过程 酶的定向进化 主要过程： 1、随机突变（产生基因多态性） 2、构建突变基因文库（将突变基因与适当的 载体重组） 3、突变基因的筛选（获得正突变） Contents of chapter 8 8.1 酶基因的随机突变 随机突变的技术 无性突变技术： 易错PCR (error-prone PCR) 有性突变技术： DNA 改组 (DNA shuffling) 交错延伸PCR 随机引物体外重组 基因家族重排 PCR 1. 易错PCR技术 易错PCR技术(error-prone PCR) ： 从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，而引起基因突变的技术过程 1、易错PCR Taq酶不具有3’?5’ 方向的外切酶活性，有一定的错配几率（5×10-5） 易错PCR：提高PCR过程的错配几率 1、易错PCR 方法： 改变4种底物的浓度比，或降低一种dNTP的量（降至5％-10％），同时加入dITP来代替被减少的dNTP； 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ 提高Mg2+浓度 1、易错PCR 优点：操作简便，随机突变丰富； 缺点：正突变概率低，突变基因文库较大，文库筛选工作量大；适用于较小基因的定向进化 难点：要控制好突变率 1、易错PCR 连续易错PCR： 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。 有性进化！ 2. DNA重排 定义：又称为DNA改组技术，是从两种以上同源正突变基因出发，用酶（DNaseI）切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。 原理：DNA片段互为模板和引物，进行扩增和延伸时碱基序列会重新排布而形成众多的突变基因，分离出全长突变基因后再进行常规PCR扩增以进行定向选择。 结果：将存在于不同基因中的多种正突变结合在一起。 不需加DNAI的DNA重排技术 交错延伸PCR 随机引物体外重组技术 交错延伸PCR(1997, Arnold) Stagger extension process, SEP 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步, 缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而交替延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。 随机引物体外重组(1998, Arnold) RPR (Random-priming in vitro recombinatoion) 在以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段。 去除模板后，在随后的PCR反应中，它们互为引物和模板进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。 基因家族重排技术（1998,Crameri） 单一酶分子基因：进化过程中集中有利突变速度较慢 基因家族：由于基因之间存在显著差异，所得突变库体现了基因多样性和增加了有利突变的概率 由于定向进化的高效性，被认为是DNA改组的发展方向 Contents of chapter 8 8.2 突变基因文库的构建 定向选择： 先把随机突变获得的突变基因做成基因文库，再从中筛选出有用的突变基因。 8.2 突变基因文库的构建 文库的包容性：足够大容量，利于之后筛选的全面 文库的完整性：足够完整的DNA片段，利于之后筛选出完整的进化酶 8.2 突变基因文库的构建 过程： 载体的选择（质粒、噬菌体载体、黏粒质粒、噬菌体质粒） 基因重组（酶切+连接） 形成基因文库（转化或转染） Contents of chapter 8