蛋白质与酶工程第三章酶的分离纯化层析技术介绍.ppt

第四章 层析技术 引言 层析法的发现与进化历史 思想 层析法的基本原理 根据引言内容,是否可以总结概括出层析法的基本原理？ 层析法的分类 引言 探索与发现 2 1906年俄国植物学家茨维特（Michael Tswett）: 将碳酸钙细粉装入玻璃瓶， 石油醚抽提叶子的色素溶液倾入， 接着倒入石油醚洗涤， 柱上部出现了绿色的叶绿素， 中间是黄色的叶黄素， 而在下面则是胡萝卜素橙黄色 色带叫作“色谱”， 方法叫色谱法（Chromatography), 层析法 。 概念: 相同时期发生在中国大地的事件 塔板理论 将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内不同组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡 液相色谱与气相色谱法比较 层析法的基本原理 层析法是利用混合物中各组分物理、化学性质（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等）的差异使各组分在两相（固定相和流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 层析法的分类 （1）按流动相状态分类： 　液相色谱 液-固层析 　　 液-液层析 　气相色谱 气-固层析 气-液层析 （2）按层析原理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能 的差异，达到分离鉴定的目的。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间 的分配系数（或溶解度）不同。 离子交换层析:利用不同组分对离子交换剂亲和 力的不同。 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组 分阻滞作用的不同。 层析技术 第一节 吸附层析技术 吸附柱层析 薄层层析 聚酰胺薄膜层析 疏水层析 第二节　分配层析技术 第三节 凝胶过滤层析技术 一、基本原理 概念：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，因分子大小不同而分离。又名分子筛层析。 四、 凝胶过滤在试验室中的应用 1）生物大分子物质的分离纯化 2）分子量的测定 3）脱盐及去除小分子杂质 4）溶液浓缩 5）去热源物质 第四节 离子交换层析法 一、原理:是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法 。 离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。 四、离子交换层析的实验室应用 除去离子（纯净水） 聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面 分离纯化 改变成分（青霉素-Na＋——青霉素-K＋ ） 浓缩与提取（抗生素、蛋白质、工业废液中微量金属的提取） 离子型化合物分离 发展：自动化方向 　与光谱技术结合－专门用途的综合性自动分析仪与计算机相连－进行自动分析与自动控制 第五节 亲和层析法 原理： 利用生物大分子间特异的亲和能力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体等。 亲和层析包括三个共价结合的组分：不溶性的基质（matrix ）、一个间隔臂（spacer）及特异的配基（ligands） Fraction and monitoring An actual example for gel-filtration 第六节 高压液相层析（HPLC） 特点： ①使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高.（颗粒细，理论塔板数多） ②溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。（颗粒硬度大、流速快，耐高压） ③重复性好 ④色谱柱可以反复使用 ⑤自动化操作，分析精确度高 许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。 层析基本原理 固相，流动相，色谱柱的概念 洗脱体积，洗脱曲线的概念 凝胶过滤层析 高压液相层析 离子交换层析 亲和层析 吸附层析 分配层析 (薄层层析 ) 三、吸附剂 1.吸附剂的选择及预处理：活性多孔固体，表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰石等。 羟基羟基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2],可用于分离蛋白质、酶、核酸及病毒等生命物质。其表面有Ca2+和PO43-两种带电基团。 羟基磷灰石层析在实验室中最大的用途是分离双链DNA和单链DNA。亦可除去混合物中的DNA。 G吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。 适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。 性