cDNA测序和表达谱研的究.pptVIP

cDNA测序和表达谱研究;一、cDNA测序;UniGene： 为了弄清EST间的关系，美国国立生物技术信息中心(NCBl)根据EST相似性比较进行聚类分析，形成数据库UniGene (／UniGene) 当前cDNA测序的趋势: 由对EST的随机测序， 转向全长cDNA的克隆和测序。;全长cDNA; ;(一)大规模EST测序流程;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;1. cDNA文库构建;(1)oligo-dT引物定向克隆cDNA文库;(2)CapFinder-PCR/oligo-PCR文库;(3)均一化cDNA文库;(4)减式cDNA文库;2．EST测序;②PCR扩增产物测序： 已为多数基因中心所接受， PCR模板：cDNA文库所转化的菌落、细菌裂解液或抽提的质粒； PCR扩增产物：经适当处理如纯化或酶处理等，即可进行测序。 ②与①比较：费用较为便宜，使用人员也较少，但由于文库中插入子大小不一，可能会导致PCR结果不稳定?? 模板制备的质量控制： 极其重要，影响测序成功率的重要因素，各个环节均要质控。 大规模EST测序所用模板制备多采取流水线作业方式，有条件者，可实现自动化。;大规模EST测序;5‘端测序。 优点: 常规cDNA文库所获克隆较少含有5’端非编码区，而多在ORF内，5‘端测序的结果较容易判断是否新基因。 缺点: 不便于与UniGene比较，会过高估计所获得的新EST。 要求：所测EST顺序的长度应大于100bp，错误率或不能识别的碱基小于3％;ORF;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;3．信息传输、处理和管理;4．生物信息学分析;用生物信息学分析所获得的EST测序结果是最重要的环节。 要求：研究者要有渊博的生物学知识、计算机技术和应用互联网资源的能力。 本地的数据库不仅储存、加工自己的EST数据，更重要的是要收集、储存并定期更新来自国际权威机构的核苷酸及蛋白质数据库信息。 要有一些应用软件能进行比较、排列、检索、结构预测。 国际上常用软件系统：GCG(genetics computer group)软件包，有定期更新的核苷酸及蛋白质数据库及二百多个应用软件构成，可基本满足EST序列分析的需要。;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;EST分类;在组织基因表达谱分析时，要进行统计学分析： ① EST测序过程中，基因克隆数符合Poisson分布 ②利用定量基因表达谱分析软件，通过聚类分析，将所测EST大部分可归于不同的UniGene。 UniGene： ①多个EST组成，能相互重叠，可以形成较长的重叠序列。 ②按理论，每一个UniGene可能代表一个基因，即聚类分析的目的是将所测EST归于不同基因。;(二)全长cDNA的克隆;EST的利用： ① UniGene数据库 为电脑克隆全长cDNA提供了便利的条件。 ②通过IMAGE协会 (the Integrated Molecular Analysis of Genomes and their Expression) 该协会由美国和法国的4个研究机构组成， 目的是收集所有的EST克隆和顺序，并且这些克隆可以提供给研究人员。;大量获得全长cDNA的策略;;大规模全长cDNA测序方法;②电脑克隆全长cDNA;cDNA末端快速扩增法(RACE);全长cDNA在克隆过程中和克隆后，尤其重要。 互联网上可以利用的信息： 软件：比较基因组软件COG，基因组库GDB和遗传病表型库OMIM等。 与核苷酸和蛋白质数据库进行同源性比较: ①可以提示所获顺序是否新基因，是否一个基因家族的新成员，是否在生物进化过程中保守。 ;②利用结构功能域(domain)、基序(motif)及二级和三级结构预测，可以提供新基因是否有功能相关的特殊结构，是否分泌蛋白、受体、信号传导分子、酶及转录因子等有关信息，为进一步研究提示方向。 ③电子组织表达谱是利用与新基因相匹配的EST来源，推测新基因组织表达分布，具