重组人神经肽Y受体Y2融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究论文.docVIP

　　重组人神经肽Y受体Y2融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究论文 丁克祥 董萍 郑永晨 杨永鹏 朱晓亮 韩晋云 单志新 丁宇 丁振华 【摘要】 目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y Y2受体，并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析。方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28aY2转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDSPAGE检测和ethods The rebinant plasmid pET28aY2 ed atography. Then bioinformatic analysis of the Y2 receptor id pET28aY2 expressed rebinant human Y2 receptor protein. Highly purified fusion protein atography. Related biological characteristics of Y2 receptor id pET28aY2 can be successfully expressed in DE3. Highly purified proteins can be obtained by Ni2+NTA affinity chromatography. Y2 receptor′s biological characteristics are predicted, ent. 【Key atics 神经肽Y(NPY)是由36个氨基酸组成的多肽,属于胰多肽家族,作为一个信号分子在不同物种间有高度的保守性。人体内NPY相关的受体主要存在于中枢神经组织中,此外在外周组织也有分布。其中与脂肪组织相关的受体主要有Y1、Y2和Y5〔1，2〕。NPY通过与其受体Y2(NPY2R)的作用刺激内皮细胞增殖分化,在血管生成过程中重要的作用〔3，4〕，Kuo等〔1〕的研究表明NPY在脂肪重塑、饮食诱导的肥胖加剧及伴随的代谢综合征形成中有重要的作用。他们认为,NPY与NPY2R相互作用,通过血管生成引起内皮细胞及脂肪细胞的增殖、分化，表明NPY及NPY2R可作为媒介用以增加移植脂肪组织的体积和存活。 1 材料与方法 1.1 材料 E.coli BL21(DE3)、含有测序正确的重组质粒pET28aY2的保存菌均由本室保存;蛋白Marker购自TaKaRa公司;鼠抗人Anti6×His抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG 均购于天根生化科技有限公司;镍离子亲和层析预装柱及化学发光显色试剂购于QIAGEN公司;蛋白电泳仪、电转移仪(BioRad公司);cientzIID超声细胞粉碎机为宁波新芝科器研究所产品;其他所用试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 重组人NPY2R融合蛋白的诱导表达 用接种环沾取少量含有重组质粒pET28aY2的保存菌，于LB(Kan+)平板上划线，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种于5 ml LB (Kan+ )液体培养基，37℃振摇培养过夜。次日取培养过夜菌液500 μl 再接种于50 ml选择性LB 液体培养基中，振荡培养至OD600值达0.6。吸取1 ml后加入IPTG，终浓度为1 mmol/L，37℃继续诱导培养4 h。取加IPTG前和后的菌液各1 ml，12 000 r/min离心5 min，收集菌体沉淀，并于沉淀中加50 μl蒸馏水，混匀后再加2×SDSPAGE上样缓冲液50 μl，混匀，沸水浴5 min，12 000 r/min离心10 min，每个样品取20 μl上样于10%的SDSPAGE凝胶电泳，电泳结束后取考马斯亮兰R250染色2 h，然后脱色，拍照记录结果。 1.2.2 包涵体的释放 据上所述，在2 000 ml的摇瓶中装500 ml的LB液体培养基扩大诱导规模。将诱导表达菌液，4℃，5 000 r/min，离心15 min，收集菌体沉淀;加入25 mlPBS，吹打充分悬浮菌体沉淀，4℃，12 000 r/min，离心30 min，弃去上清，依此反复冲洗菌体沉淀3次;加入细胞裂解液25 ml，吹打使菌体沉淀均匀悬浮;将菌体沉淀悬浮液置-20℃冷冻，再于室温融化，如此反复冻融3次;4℃，12 000 r/min，离心细菌冻融液30 min，弃去上清，在沉淀中加入超声裂解液25 ml，吹打混匀;置冰上对细菌冻融液进行超声处理，10 min/次，处理时间30 min;超声处理后，于4℃，12 000 r/min，离心30 min，弃去上清，沉淀为菌细胞裂解沉淀物。 1.2.3 包涵体的提纯 于菌细胞裂解沉淀物中加入含4 mol/L尿素的包涵体提纯液25 ml,吹打混匀，室温静置30 min,