限制热量对NIT1细胞胰岛素-胰岛素样生长因子通路及胰岛素分泌功能的影响论文.docVIP

　　限制热量对NIT1细胞胰岛素/胰岛素样生长因子通路及胰岛素分泌功能的影响论文 朱志宏 陈慎仁 傅玉才 魏炽炬 杨杰华 林超 【摘要】 目的 研究限制热量(CR)对胰岛素β瘤细胞(NIT1)细胞胰岛素/胰岛素样生长因子(IGF1)信号通路及胰岛素分泌功能的影响，为2型糖尿病（T2DM）的发病机制及防治提供实验依据和理论基础。方法 NIT1细胞培养至指数生长期，分别用PI3K的阻断剂LY294002(LY)进行干扰，实验分成4组：对照组；CR组；LY+CR组；LY组。用RTPCR、免疫细胞化学等方法检测Foxo1及其下游基因的转录及表达，用放射免疫及免疫细胞化学法检测胰岛素的分泌及表达，用细胞计数法检测细胞倍增周期。结果 ①CR可使NIT1细胞倍增周期延长；②Foxo1主要定位于胞浆，阻断PI3K后Foxo1从胞浆移入胞核，mRNA转录减少；③CR在正常状态及PI3K通路障碍的细胞均可使Foxo1mRNA转录增加.freel的转录；④PI3K通路障碍可使NIT1细胞胰岛素分泌增加，CR则可使PI3K通路障碍的NIT1细胞胰岛素分泌减少。结论 CR不需通过上游PI3K/Akt，可直接或间接作用于Foxo1参与对胰岛素/IGF1信号通路的调控，延长细胞寿命，增强NIT1细胞的糖耐量，改善胰岛素信号的传导及NIT1的胰岛素分泌功能；可能参与了T2DM的发生发展。 【关键词】 限制热量；胰岛素/胰岛素样生长因子；Foxo1；胰岛素；2型糖尿病 【Abstract】 Objective To investigate the effects of Calorie Restriction (CR) on insulin/IGF1 signal pathedium, another glucose ulated by LY294002 (LY), the blocking agent of PI3K. Samples and FasL munocytochemical assay. The secretion and expression of insulin munity and immunocytochemical assay. The cell multiplication cycle easured by cytometry. Results ①CR extended the cell multiplication cycle; ②Foxo1 , it moved into the nucleus and diminished its transcription atter the PI3K path of PI3K/Akt, CR could directly or indirectly effect the activity of Foxo1, so that to regulate the insulin/IGF1 signal pathprove the conduction of insulin signal and the function of insulin secretion. Therefore, CR may participate in the generation and development of T2DM. 【Key 及FasL等的调控，从而影响β细胞寿命及胰岛素分泌，改善PI3K/Akt功能障碍所致的胰岛素信号传导障碍及IR，参与T2DM的发生发展。本研究在细胞水平观察CR对胰岛素β瘤细胞(NIT1)细胞寿命、胰岛素的分泌功能及IR等的调控作用，为T2DM的发病机制提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 实验材料 实验细胞：NIT1细胞由美国标准菌库（ATCC）保存，ATCC○R号：CRL2055TM。NIT1细胞系来自NOD/Lt 小鼠胰腺胰岛β细胞，是转染了肉瘤病毒40（SV40）后自发的胰岛素瘤细胞，培养基中的葡萄糖可刺激它分泌胰岛素，与胰岛β细胞有非常相似的生理功能。主要试剂：胎牛血清FBS（KPL）、高糖（0.45%葡萄糖）DMEM（Gibco）、无糖DMEM（Gibco）、胰酶+EDTA（Gibco）、兔抗鼠Foxo1抗体（Santa cruz）、小鼠抗鼠p27抗体（Sigma）、兔抗鼠Bim抗体（Santa cruz）、羊抗鼠FasL抗体（R D）、鸡抗鼠胰岛素抗体（Abcam，ab14042）、辣根过氧化物酶标记（HRP）的山羊抗鸡二抗（KPL）、生物素标记的山羊抗兔IgG抗体（KPL）、兔抗小鼠IgG二抗（Sigma）、兔抗羊二抗（KPL）、ABC试剂盒（Vector Laboratories）、LY294002（