基因工程-7章pcr技术及其应用.ppt

PCR反应的模板 重组质粒DNA 基因组DNA RNA 菌落 空斑形成单位又称蚀斑形成单位，是计量病毒（或噬菌体）的一种单位，但只限于用在有产生空斑能力的病毒。其原理是：用少量有破坏宿主细胞能力的病毒去感染已形成致密单层状态的宿主细胞群体时，经过一定培养时间使每个感染细胞周围的细胞逐渐感染崩溃，形成肉眼可见的空斑（噬菌体时可直接观察，病毒时则需借助于活体染色的方法）。在理论上，一个病毒体就可以形成一个空斑，但实际上有不同程度误差，因此不能准确的与其他计量单位互换。用PFU计量病毒的方法叫作PFU法。 （1） SYBR Green I 检测模式 通过PCR反应生成双链DNA，SYBR? Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。 SYBR Green I 的优点：SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链 DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。 4. 考古学中生物种类间的亲缘关系、进化途径判定 5. 基因动、植物的检测 ⑴转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。 ⑵转基因植物的检测：玉米、大豆等。 物种进化图 * * 1、要求将下面基因片段克隆至表达载体pET-28a相应位点上，并获得此基因的表达。 ATG GGT CGG CAT GCT GAT ACA GAT AAT AAT TTC TCA AAG GAC CAT GGT TGG TAT TTA GCT TAT TCT ATA CCT GAC ACA GGG GAA TCA CAA ATA AGA AAA TTT TCA GCA TTA GCT AGA TAT GAA TGG CAA AGA GGA AAC TAT AAA CAA GCT ACA TTC TAT CTT GGA GAG GCT ATG CAC TAT TTT GGA GAT ATA GAT ACT CCA TAT CAT CAA GCT TAT GTT ACT GCC GTT GAT AGC GCA GGA CAT GTT AAG TTT GAG ACT TTT GCA GAG GAA AGA AAA GAA CAG TAT AAA ATA AAC ACA GCA GGT TGC AAA ACT AAT GAG GCT TTT TAT ACT GAT ATC TTA AAA AAC AAA GAT TTT AAT GCA TGG TCA AAA GAA TAT GCA AGA GGT TTT GCT AAA ACA GGA AAA TCA ATA TAC TAT AGT TAA 2、限制性核酸内切酶识别的碱基序列如下： BamHI:GGATCC, EcoRI:GAATTC, NcoI:CCATGG,HindIII:AAGCTT 3、保护性碱基情况：BamHI:CGCGGATCCGCG, EcoRI:CCGGAATTCCGG, NcoI:CATGCCATGGCATG,HindIII:CCCAAGCTTGGG 回答如下问题： 1、设计1对PCR引物，写出F和R 的引物序列，并简述PCR引物设计的基本原则。 2、如果用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，应该用多大浓度的琼脂糖凝胶比较合适？ 3、如果没有得到PCR产物，可能存在哪些问题，如何解决？ 4、如果PCR产物在琼脂糖凝胶电泳时呈现片状，可能存在哪些问题，如何解决？ 5、如果PCR产物在琼脂糖凝胶电泳时，其特异性不够，可能存在哪些问题，如何解决？ 在进行PCR时，遇到一些问题时的解决办法： 1．没有得到所希望的PCR产物 ①确证是否加入酶，检查酶是否有活性； ②DNA解链是否充分； ③人工合成的引物是否正确； ④在未加 Taq DNA聚合酶以前，将反应系统在95℃保温5～10分钟，使蛋白酶及核酸酶失活。 2．PCR产物在凝胶电泳中呈片状 ①减少Taq DNA聚合酶的浓度； ②增加退火温度； ③降低Mg2+浓度； ④减少退火时间及延伸时间； ⑤减少周期次数； ③从凝胶中回收与所希望的DNA片段