染色体水平上的DNA与蛋白质相互作用分析.PPTVIP

染色体水平上的DNA与蛋白质相互作用分析 ——CHIP-chip技术的应用 彭公峰 刘明明 王鹏 潘静 背景介绍 DNA与蛋白质之间的相互作用是指顺式作用元件与反式作用因子之间的特异识别与结合，从DNA复制﹑转录﹑翻译﹑基因表达调控到染色质的组装，都涉及到DNA与蛋白质的相互作用。大部分结合蛋白有自己的DNA结合结构域，主要分为leu拉链﹑螺旋-转角-螺旋﹑螺旋-环-螺旋﹑锌指结构以及同质异形结构域几种结构模序，它们靠对DNA螺旋大沟中的氢键的特异识别，以非共价键与DNA结合，来执行不同的功能。 文献内容 CHIP-chip(染色体免疫沉淀芯片技术）是分析DNA与蛋白质相互作用的有力工具，文献综述了该技术在分析DNA-蛋白质相互作用的最新研究进展，这些研究为理解转录与蛋白质组装过程提供了新的思路。 CHIP-chip技术原理 染色质免疫共沉淀-芯片（ChIP-chip），它的基本原理是在生理状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联在一起，超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 染色质免疫沉淀芯片流程图 CHIP-chip技术流程 CHIP-chip技术的优点 1.直接对活细胞进行作用，可以真实地反应体内DNA与蛋白质的相互作用 2.甲醛的固定，可以检测到细胞某一时刻的DNA与蛋白质的相互作用 3.染色体免疫沉淀与芯片技术的结合，可以在整个基因组水平上分析DNA与蛋白质的相互作用 CHIP-chip技术的研究进展 CHIP-chip技术主要应用于寻找转录因子在DNA上的结合位点以及判断基因是否被表达，通过对得到的实验结果的分析，丰富了我们对DNA-蛋白质相互作用的认识，本文主要在以下几个方面对技术的应用以及DNA-蛋白质相互作用的新现象进行了介绍。 1.CHIP-chip在转录因子结合位点方面上的研究 ⅰ2002年，科学家应用此项技术确定了酵母菌序列特异性转录因子的结合位点，为确定这些转录因子的功能提供了参考。 ⅱ在生理状态下进行染色质免疫沉淀，发现无论基因是否处在转录激活状态，转录因子都会结合在特定位点。 ⅲ通过对LexA的研究，发现E.coli的基因组是 有利于转录因子结合的。 2.确定已知蛋白的靶基因 在DNA与蛋白分离后，进行PCR扩增，然后与芯片进行杂交，可以确定已知蛋白的靶基因，运用这种方法，可以确定某一蛋白在染色体上的靶基因群。 3.证明了转录因子有时结合在非交感顺序上 通过对CtrA,FNR结合位点的分析，发现有时其结合在非交感顺序上，推测DNA拓扑结构的改变影响了其序列特异性，或者是许多转录因子的协同作用，减少了特定转录因子的需求或者改变其序列特异性 4.转录因子有时结合在DNA位点但不执行功能 CHIP-chip的应用过程中发现，将FNR剔除，并不影响其邻近基因的表达 推测可能是以下几种原因： 1.结合部位没有启动子 2.转录因子不是调控转录，如NAP（nucleoid-associated protein核酸连接蛋白）调控染色体组装 3.大量转录因子存在的情况下，可能执行其他功能 4.可能其他因子对该基因影响更大 5.基因组在发生进化，基因结构发生变化 5.对细菌染色质组装蛋白的研究 确定了细菌染色质组装蛋白NAPs具有很低的序列特异性，发现H-NS(一种NAPs)对富含AT的区域有亲和性，并且可以导致基因转录沉默，主要是靠结合启动子上的RNAP来实现转录阻遏的。 6.确定RNAP在转录序列上的组装以及启动子在基因组上的分布 运用CHIP-chip技术，发现在对数生长期的E.coli中， RNAP在promoter上停留时间比在编码序列上长50倍。RNAP结合在至少90个转录区域中，至少存在有1100个启动子，发现σ70结合的启动子，其对应的基因至少有?没有发生可观察到的转录现象。 7.对σ因子的研究 确定了σ70与σ32在细菌基因组上的分布，发现大部分依赖σ32的启动子，可以由σ70来促进转录 8.在其他水平上的研究 运用该技术对DNA结合蛋白进行研究，发现三个不与转录相关的蛋白，其中两个（RacA,SPO0J)在DNA复制后的染色体分离 中起作用 对CHIP-chip技术的展望 1.不仅可以应用在转录阶段，在DNA复制﹑修复﹑重组﹑染色质组装﹑染色体分离方面都可以得到广泛的应用。 2.通过对不同σ因子的定位来对染色体进行分区，为