石油污染和微生物群落结构相互影响.docVIP

石油污染与微生物群落结构的相互影响 李玉瑛1，郑西来2，李 冰2 1. 五邑大学化学与环境工程系，广东 江门 529020；2. 中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266003 摘要：从两种土壤中分别分离出石油烃降解菌，并从中筛选出6株石油烃高效降解菌A1、A2、A6、A8和B2及B5，然后将各菌株鉴定至属，分别为A1假单胞菌属、A2鞘氨醇单胞菌属、A6微球菌属、A8节杆菌属、B2不动杆菌属和B5诺卡氏菌属。另外对比分析了单菌株及不同菌株重组对不同石油烃组分的利用情况，结果发现，从不同石油污染的土壤中分离到的菌株对石油烃组分的利用能力不同，从胜利原油污染的土壤中分离到的菌株A1、A2、A6和A8对石油烃组分的利用范围窄，主要利用饱和烃组分；而从经芳香烃驯化过的土壤中分离到的菌株B2及B5对石油烃利用组分的利用范围较宽，能同时利用饱和烃和芳香烃组分。 关键词：石油污染；石油烃降解菌；柴油 中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2006）02-0248-05石油及其制品的应用越来越广泛，但在为人类文明带来巨大利益的同时，在其生产、加工、运输和使用过程中使大量的石油污染物进入了环境，对土壤和水体造成严重的污染，破坏了生态系统，并危及人类健康，因此对石油污染的处理已迫在眉睫。目前，生物修复技术由于环境影响小、无二次污染、降解过程迅速和费用低等特点，已成为一种新的可靠的环保技术[1]。 土壤中存在着大量的微生物，其中可以利用石油烃物质作为碳源和能源的并不多。但土壤被石油污染后，会有选择性地抑制土壤中一部分微生物的生长，同时有一部分在石油烃污染物的长期选择下，能够利用石油烃作为碳源和能源而大量生长。Atlas[2]曾报道，降解烃类的微生物一般只占微生物群落总数的不到1%，而当有石油污染物存在时，降解烃类微生物比例增加到10%。Balla等人(1998)[3]发现在利用土壤耕作处理石油污染土壤时微生物数量增加了4个数量级。在对石油污染的土壤进行生物修复的过程中，微生物是此过程的主体，生物修复的成功与否主要取决于土壤中有效利用石油烃的微生物存在与否及其活性大小。尽管对微生物降解石油的研究很多[4-5]，但多数研究着重于单株菌对石油烃的利用能力、影响因素或分析降解过程中的中间产物[6-8]，而忽视了石油污染对微生物群落结构之间的相互作用。本文分别从长期被石油污染的土壤中及原先无石油污染而经芳香烃驯化后的土壤中筛选分离出可以利用石油烃物质的细菌，并对其利用石油烃的能力作了进一步探讨。 1 实验材料与方法 1.1 分离源 用来富集石油烃降解细菌的土壤源包括取自齐鲁石化炼油区被石油污染的土壤与原先无石油污染而经芳香烃驯化3个月的土壤。 1.2 主要培养基 无机盐培养基(g/L)：KCl 0.7，KH2PO4 0.2，NaHPO4 0.3，NH4NO3 2.0，MgSO4·7H2O 0.004，FeSO4 0.0002，MnCl2 0.0002，CaCl2 0.0002；蒸馏水 1 L, pH调节为7.0。121℃灭菌20 min。 固体培养基(g/L)：琼脂 18，(NH4)SO4 0.5，NaHPO4 0.2，柴油 4.0；蒸馏水 1 L，pH调节为7.0。 121 ℃灭菌20 min。 肉汤培养基(g/L)：牛肉膏 3.0，蛋白胨 10.0，NaCl 5.0；蒸馏水 1 L，pH调节为7.0。121 ℃灭菌20 min。 1.3 石油烃降解菌的富集、分离和纯化 1.3.1 富集 用来富集石油降解细菌的土壤源包括取自齐鲁石化炼油区被原油污染的土壤与经芳香烃驯化的土壤。称取15 g油污染土壤到经过灭菌的250 mL的三角瓶中，加入150 mL无菌蒸馏水并加入少量的无菌玻璃珠，然后在28 ℃（200 r/min）培养3 h。静置30 min，取10 mL上清夜置于分别装有150 mL经灭菌的加0.5％柴油的无机盐培养基的250 mL三角瓶中，在28 ℃（200 r/min）培养10 d后，静置30 min，取上清夜10 mL转接至加有柴油的新鲜无机盐培养基，重复上述步骤连续富集培养5次。得到的培养液记作混合菌A。 取一定量无石油污染的土壤，加入适量的N和P等营养和适量的蒸馏水，再加入0.5％的芳香烃进行驯化3个月。然后该土样中富集可以降解柴油的细菌，步骤同上，得到的培养液记作混合菌B。 1.3.2 分离纯化 吸取上述混合菌液A 1 mL，稀释105、106、107、108、109倍，然后分别取不同稀释度的菌液涂布于固体培养基平板上，培养3～5 d后，选择生长较好、菌苔较大的菌落，用接种环挑取至该菌落固体培养基平板上划线分离、纯化，连续纯化分离3～5次，得到的石油降解菌菌