enzymology 3b2离子交换色谱.pptVIP

 离子交换剂是一类能显示离子交换的功能高分子材料。 功能基由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动离子两部分组成，两者所带电荷相反，以静电力结合。 可进行交换的离子称为反离子或抗衡离子，可与溶液中带同种电荷的离子进行交换反应。 离子交换剂通过交换和再生可以反复使用。 若蛋白质在高于等电点的pH范围内稳定， 操作方式：间歇式分批操作：batch又叫静态处理，将离子交换剂泡于工作液中，达到平衡后，滤出介质进行洗脱。柱式操作：又称动态法，交换、洗脱、再生等步骤均在柱内进行。 酶分离纯化的方案设计 b. Sketch the elution profile of these proteins from a carboxymethyl cellulose ion exchange chromatography column, run at pH 6.25 (with a salt gradient, if necessary). Label the peaks. ● 抹香鲸肌红蛋白 (pI = 8.2) 超过 马肌红蛋白 (pI = 7.4) Pharmacia The following information is known about four proteins: 4 identical, 50,000 each 5.8 200,000 D 1 6.2 35,500 C 1 9.1 14,200 B 1 5.2 13,100 A Subunits pI Mr Protein 电荷差异——离子交换法 1 原理概述：离子与固体载体带电基团间的争夺战 2 交换剂：是帶有电荷的长链大分子聚合物 3 缓冲液与层析系统：缓冲液的影响极大 4 管柱操作方法： 如何操作一根离子交换管柱 5 色谱聚焦法： 依蛋白质等电点不同来进行分离 .离子交换色谱 通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离目的的方法。主要以两电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。 ■ 阴离子交换法 Anion Exchange： 载体 + + + + + + + + + + + + + + + + 样本分子 流动相 固定相 阳离子基团 Counter ion 阴离子 + 能与阳离子进行交换反应的称为阳离子交换剂能与阴离子交换的为阴离子交换剂 Mono bead ■ 各种离子交换剂： Strong Weak Weak Strong Resin / Polystyrene Glycan / Cellulose = X Anion Exchanger Cation Exchanger IRC-150 Dowex-50 Dowex-1 Dowex-2 Dowex-3 IR-45 -NHR 2 + - -SO 3 -NR 3 + -COO - X = Sephadex, Sepharose, Sephacel or cellulose CM-X DEAE-X TEAE-X (QAE-X) Phospho-X 阴阳强弱分类 S Q -OCH CH NHR 2 2 2 + -NR 3 + 4 2- -PO 2 - -OCH COO ■ 选 择 离 子 交 换 剂 + Net Charge of a Protein Buffer pH pI - 3 4 5 6 7 8 9 10 0 阴离子交換 阴离子子交換 ■ 质子可以吸附或脱离一基团： Proton： 最小且最多的生物粒子，影响酸碱度及分子帶電性质 H+ lone pair electrons H H H+ N H H N 胺 基 H+ 羧 基 C O O H C O O 类型：强酸、强碱、弱酸、弱碱等 H3+N-R-COOH H2N-R-COOH H2N-R-COO-+H2O 阳离子形式 等电点（R大分子链） 阴离子形态 pH pI pH’ 若蛋白质在低于等电点的pH范围内稳定， 若蛋白质在低于或高于等电点的pH范围内都稳定，则既可用阳离子交换剂也可用阴离子交换剂，此时取决于工作液的pH值及杂质的带电情况。 带正电荷，则与阳离子交换剂进行交换反应； 带负电荷，则与阴离子交换剂进行交换反应； ■ 离子取代优先顺序 Pecking Order： ++ + + + + + + + + + + + + + + + + 电