实验四酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素.docVIP

实验四 酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素 一 了解ELISA的基本原理，及其优缺点； 掌握间接ELISA法的试验操作过程。 二 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是免疫酶技术的一种。本方法测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的特异性单克隆抗体，加入黄曲霉毒素标准品（或样品溶液）及黄曲霉毒素B1 酶标记物，标准品（或样品溶液）中的游离黄曲霉毒素B1 与黄曲霉毒素B1酶标记物竞争黄曲霉毒素B1 抗体，没有连接抗体的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将基质/发色剂加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将基质/发色剂转化为蓝色的产物，加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色，在450nm 处测量，吸收光强度与样品中黄曲霉毒素B1的浓度呈负相关。 三、ELISA试剂盒 其组成如下： 1.1 包被抗体的反应板 48孔 1.2 A试剂：样品稀释液 l瓶 1.3 B试剂：AFB1标准溶液 l套(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ng/mL) 1.4 C试剂：酶标抗原 l瓶 1.5 D试剂：酶标抗原稀释液 l瓶 1.6 E试剂：浓缩洗涤液 l瓶 1.7 F试剂：显色底物液a l瓶 1.8 G试剂：显色底物液b l瓶 1.9 H试剂：终止液 l瓶 1.10 反应板框架 l块 2、仪器 1.1 酶标仪(内置450nm滤光片) 1.2 50μL微量移液器及配套吸头 1.3 恒温培养箱(0℃-50℃) 1.4 冰箱(4℃-8℃) 1.5 感量0.0lg的天平 1.6 调速振荡器或超声波清洗器 1.7 离心机5000r/min 1.7 玻璃器皿：具塞锥形瓶，烧杯，分液漏斗，普通漏斗，量筒，具塞试管，滴管，移液管等 1.8 小型粉碎机或碾钵 1.9 其它：滤纸，吸水纸等 四、实验步骤 1、实验准备 1.1 样品处理：详见试剂盒说明书所列“样品处理方法”及“黄曲霉毒素国家允许量标准及样品稀释表” 1.1.1 脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等) 称取5.0g样品(已粉碎)于100mL具塞三角瓶中，准确加入25.00mL甲醇水(1+1)溶液，于振荡器上剧烈震荡15min，过滤，弃去l/4初滤液，收集试样滤液，此液为样品提取液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适当稀释（如100μL样品提取液+100μL样品稀释液，总稀释10倍），即为待测样液。 1.1.2 花生 样品去皮粉碎(刀切或剪切)，称取5.0g于100mL具塞三角瓶中。加入25.0mL甲醇水(1+1)溶液和20mL正已烷(或石油醚)，于振荡器上剧烈震荡l0min，过滤于分液漏斗中，静置分层，放出下层甲醇水提取液，此液为样品提取液，根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将提取液进行适当稀释（如100μL样品提取液+300μL样品稀释液，总稀释20倍），即为待测样液。 1.1.3 一般饲料及原料 称取5.0g样品于100mL具塞三角瓶中，准确加入25.0mL甲醇水(1+1)溶液，于振荡器上剧烈震荡15min，过滤，弃去1/4初滤液后收集滤液，此液为样品提取液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适当稀释（如100μL样品提取液+900μL样品稀释液，总稀释50倍），即为待测样液。 1.2 试剂的配制 1.2.1每瓶C试剂（酶标抗原）中准确加入1.5mL D试剂(酶标抗原稀释液)，充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，2～8℃保存。 1.2.2 取适量E试剂(浓缩洗涤液)用超纯水稀释20倍待用。例如：取3mL E试剂(浓缩洗涤液)，加57mL超纯水，混匀后制成实验用洗涤液，足够24孔使用。 2、操作步骤 2.1 试剂平衡：将测试盒于室温中放置15min以上，平衡至室温。 2.2 小孔编号：根据实验需要截取相应孔数放置反应板框架上。设定l号孔为仪器调零孔，2-7号孔为AFB1标准对照孔，其余孔为样品孔。 2.3 洗涤：每孔加入250μL左右洗涤液，洗涤液不得溢出，放置1min后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次。 2.4 反应组成：按下列步骤所示（见表1），依次加入配制好的溶液及待测样液。 第一步：l号孔加入50μL A试剂(样品稀释液)，2-7号孔分别加入系列的B试剂(AFB1标准溶液：0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL) 50μL，其余孔加入相应的待测样液。 第二