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DNA 提取 I：土壤的分子生物学特性 在前面的文章（Soil molecular biology ），围绕提取土壤样品 DNA、RNA 相关问题 做了简单的引导介绍，比如 PCR 抑制因子、裂解注意事项等。今天将详细介绍土壤微生 物 DNA 提取的细节，以及如何使用 MO BIO PowerSoil® DNA Isolation Kit 获得更好的 提取效果。 鉴于细节内容篇幅较长，此文章将分成两个部分。第一部分着重介绍研磨均质使用 的研磨珠、研磨设备和裂解缓冲液。第二部分介绍选择化学溶液以获得最好的 DNA 吸附 绑定、清洗和抽提效果。 MO BIO 实验室用于提取土壤 DNA 的试剂盒有好几种。而 PowerSoil DNA Isolation Kit 是效果最好，最受欢迎的一个。因此，在下面文章了将主要针对它来讨论。此试剂盒采 用了专利的抑制因子去除技术（IRT 技术）来去除多糖多酚等腐植质，使用了小型的离心 过滤柱和微型离心机。 需要注意的是，不同土壤微生物含量和有机物含量差异很大，DNA 得率也就有差别。 得率不单单是由样品起始量来决定，来自同一块泥土不同土层深度的样品微生物含量、 有机物组成也会大不同。 想保证每个样品得率一致很困难，因为每铲泥土可能含有不一样多的树叶、残骸、 昆虫，甚至小石子、沙子。在 MO BIO 实验室里，我们通常要对土壤样品进行过筛，去掉 大块，保证每个样品质地一致。如果样品的一致性对你的实验影响比较大，过筛是必须 的。 这点很重要，加大样品起始量，并不总是意味着可以获得更多的 DNA 。因为太多的 样品会吸收掉大部分裂解缓冲液，使得研磨效率骤降。加大样品起始量只能对个别类型 土壤来说可行。PowerSoil DNA Kit 是小量提取试剂盒。如果你需要提取多于 0.25g 的 土壤，MO BIO 提供了像 PowerMax® Soil DNA Kit 这样提 10g 土壤的，RNA PowerSoil® Kit 和配套的 DNA Elution Accessory Kit 一次提取 2g 土壤。 接下来，我们顺着 DNA 提取过程一步一步讲解。首先是裂解，尤其是机械法裂解。 步骤一：裂解 : 获得高得率完整 DNA 需要强而有力的裂解。选择研磨珠种类以及机械研磨时间需要 掌握一个平衡，使得在打开微生物细胞的同时尽量减少对 DNA 的剪切破损。使用研磨珠 击打破碎若配合温度改变，可以强化裂解作用，对于坚硬的有机物和孢子等的裂解有很 大帮助。 研磨珠类型： 适合裂解土壤微生物的研磨珠有很多种。研磨珠的类型，外形，大小都会影响到 DNA 的得率和完整性。 MO BIO 偏向喜欢用大小不一、边缘锋利的石榴石研磨珠。就因为研磨珠大小不一， 既可以打碎大块泥土，也可以照顾到小小的微生物细胞。石榴石质地较软，在使用高速 珠磨研磨机的时候会崩裂成很多小块。许多客户为了加强提取真菌 DNA 的机械裂解力， 而在 FastPrep o 或 Precellys 上使用，也能获得很好的效果。 高速强力珠磨设备长时间击打研磨，需要使用 0.5mm 或 0.1mm 玻璃研磨珠。虽然这 类研磨珠会加重 DNA 破损，但是用于孢子类坚硬有机物的裂解是有帮助的。你也可以混 合使用大小不一样的玻璃和石榴石做一个适合自己样品的研磨珠混搭。 研磨设备： 前面文章也提到过，涡旋仪研磨法是获得完整 DNA 最省钱的研磨方法。实验证明， 配合我们的裂解缓冲液处理 0.25g 土壤样品，10min 的涡旋时间是最合适的。延长涡旋时 间并不能增加得率，反而让 DNA 破损增大。 Precellys 或 FastPrep 也是个不错的选择，如果你的实验室有，并希望加强裂解 效果。大多数客户提取细菌、真菌 DNA 的时候，把 FastPrep 调到 5 档，研磨 45s 到 1min。 FastPrep 上的 5 档相当于 Precellys 的 5200rpm。也有些客户喜欢用 4 档（相当于 Precellys 的 5000rpm），每个样品 15-30s，3~4 个循环。由此可以看到，使用强力珠磨 研磨设备，还需要根据手上样品的具体情况调整研磨方案。文章尾部列举了一些在 FastPrep 上使用 MO BIO UltraClean Soil 或 PowerSoil Kits 的相关文献，供参考。 裂解缓冲液 : 另一个组成强力裂解力量崩开细