第八章植物种质资源的保存试卷.ppt

（3）预冷冻法 分步冰冻法 此法将快速和慢速2种冰冻方法结合起来。首先用较慢的速度（0.5～4℃/min）使植物材料从0℃降至一定的预冷温度（一般为-40℃）并停留一段时间（一般10min左右），使细胞进行适当的保护性脱水，然后再浸入液氮冷冻。 逐级冰冻法 植物材料经过冷冻保护剂0℃预处理后，逐级通过-10，-15，-25，-35，-40℃等，每个温度停留10 min左右，然后浸入液氮。 （4）干燥冰冻法 将样品在含高浓度渗透性化合物（如甘油、糖类物质等）培养基上培养一段时间，或者经硅胶、无菌空气干燥脱水数小时，或者用褐藻酸钙液泡包裹样品，无菌风进一步干燥，然后直接投入液氮； 或者用冷冻保护剂处理后吸除表面水分，密封于金箔中进行慢冻。 只要脱水足够，细胞内溶液浓度即可达到较高水平因而易进入玻璃化状态。这种方法对某些植物的愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、花粉、茎尖及试管苗等较合适，但对大多数对脱水敏感的材料不适用。 植物材料（培养物）的冷冻贮藏 适宜温度下贮存冷冻材料也很重要。长期内贮存在液氮内的材料，需合适的液氮容器。冷冻贮存的茎尖随保存时间的延长，其生活力可能下降。 植物材料（培养物）的解冻处理 植物材料在超低温贮存过程中所发生的冻害是在冷冻和解冻过程中产生的。 解冻过程中发生的冻害是由细胞内次生结冰造成的。 解冻过程中水的渗透冲击对细胞膜体系造成破坏。 解冻方法 快速解冻法 慢速解冻法 a、快速解冻法 是指将液氮中保存的材料直接投入到37-40℃温水浴中进行解冻的方法。解冻的升温速度为500-750℃/min，大多数植物材料可采用此种方法。 b、慢速解冻法 将液氮中保存的材料先置于0℃低温下解冻，再逐渐升至室温下进行解冻的方法。适宜细胞含水量较低的材料。 如木本植物的冬芽。 化冻后的材料需立即进行洗涤， 以除去材料组织中高浓度的冷冻保护剂，避免影响材料恢复和继续生长。最常用的洗涤方法是用含浓度为1.2 mol/L蔗糖的基本培养基25℃下处理10min，也有用浓度为1.5～2.0mol/L的山梨醇的培养液进行保护剂成分的洗涤 植物材料（培养物）的再培养 经冻存的材料会不可避免地受到不同程度的伤害。 冻存的材料一般在黑暗或弱光下培养1～2周，在转入正常光下培养。 再培养所用的培养基一般是与保存前的相同，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，有时则在培养基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等以利于生长的恢复。 组织材料 预处理 加冷冻防护剂0℃ 慢冻法-40℃或-100℃ 预冻法-70~-20℃ 快冻法 种质库（-196℃） 迅速解冻（34~40℃） 再培养 细胞生长、植株再生 超 低 温 保 存 的 程 序 超低温保存后细胞或组织活力检测 冻后存活率的快速鉴定通常采用FAD荧光双醋酸法、TTC(氯化三苯四氮唑)还原法、Evans(伊凡蓝)法等。 存活率公式 存活率（%）= ×100% 重新生长的细胞（组织）数 解冻的细胞（组织）数 （三）生长抑制剂保存 1)高渗保存法 利用培养基的高渗透压，减少离体培养物吸收养分和水分的量，减缓生理代谢过程，从而减缓生长速度，达到抑制离体培养材料生长的种质保存方法。 高渗物质：甘露醇、蔗糖、PEG等 高渗保存配合低温效果更明显 如：6~10℃低温下，培养基中加4%甘露醇，可保存马铃薯1 ~ 2年，存活率最高可达90%以上。 2)生长抑制剂保存法 在培养基中加入生长抑制剂以减缓培养材料的生长，达到长期保存种质材料的保存方法。 生长延缓剂： ABA、青鲜素、CCC、多效唑、B9等 使试管苗生长缓慢，生长健壮、叶色浓绿、移栽成活率高。 3)抑制生长的其他保存法 低压保存法：降低培养材料周围气压，达到抑制生长的目的，分为低气压与低氧压两种，保存原理相似。 饥饿法：从培养基中减去1~2种营养元素，使植株缺乏相关营养而处于最小生长量 干燥保存法：减少培养材料的含水量 矿物油覆盖法：使培养材料与空气隔绝，延缓生长 低光照培养：适当减弱光照强度，缩短光照时间，进而减缓试管苗生长 作业 名词：种质资源保存 超低温保存 问答 1.超低温保存离体种质资源的原理和一般程序是什么？ 2.限制生长保存离体种质资源有哪些方式？ 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高