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l’■； PII]I! 一s 、)l，、 ．pibb．ac．cn E92A是HIV．1整合酶耐药突变 N155S的活性回复突变术 李 杉 刘 斌 李春华 谭建军 张小轶 ” 王存新 (北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100124) 摘要 HIV．1整合酶是 目前抗艾滋病药物研发的重要靶点之一，整合酶的耐药突变是导致整合酶抑制剂类药物治疗失败的主 要原因，但突变产生耐药性的机理仍不清楚．本工作通过人工构建突变型整合酶，测试其活性和耐药性，对整合酶的耐药机 理进行初步探索．构建整合酶的突变型包括E92A、N155S两种单突变及E92AN／155S双突变．通过基因工程操作引入突变、 构建质粒 、表达纯化得到整合酶蛋 白．用基于磁珠 的整合酶链转移 ELISA测试整合酶 的链转移活性 ，用 S-1360和 Raltegravir两种抑制剂测试整合酶的耐药性．另外，用Autodock软件做了S-1360和整合酶核心区(包括野生型和突变型)的分 子对接．结果表明，N155S突变使整合酶链转移活性下降约 80％，而E92AN／155S双突变仅使活性下降约42％，这表明 N155S突变基础上的E92A突变可使整合酶的活性大幅回复．E92A和E92AN／155S对不同的抑制剂可产生不同的耐药性， 它们对 Raltegravir的耐药性强于对 S-1360．突变对整合酶活性和耐药性的影响主要是通过改变整合酶活性中心结构实现的， E92A突变可能导致其与周围残基静电相互作用减弱，间接影响到D64和Dll6残基，产生活性回复作用． 关键词 人免疫缺陷病毒(HIV)，整合酶，耐药性，回复突变 学科分类号 Q71，R966 DOI：10．3724／SP．J．1206．2013．00300 整合酶(integrase，IN)是HIV 1病毒复制周期 耐药突变，进而使药物的治疗效果降低，整合酶抑 中必需的酶之一，在 HIV．1侵入宿主细胞之后 ， 制剂也不例外嗍．HIV．1整合酶上的第 92位和 155 逆转录酶 以病毒RNA为模板合成 cDNA，整合酶 位氨基酸残基是整合酶耐药突变的高发位点 Ol， 会依次通过 3，力口工和链转移反应将 cDNA整合到 N155H、E92Q是导致 RAL、EVG等治疗失败的主 宿主细胞的染色体 DNA上 ，形成 HIV一1前病毒[”． 要耐药突变，在治疗失败的病人血液 中，具有 由于人类细胞中无整合酶的类似物，故 IN被认为 E92QN／155H双突变的HIV一1占相当大的比例 “】． 是抗艾滋病药物研发的理想靶点 ]．针对 HIV．1 在稍早期一些实验阶段的药物治疗 中，也 曾观察到 整合酶这一靶点， 目前 已开发出多种抑制剂作为治 N155S突变[12]，此突变也会带来很强的耐药性并产 疗艾滋病的药物，其中s．1360是第一个进入临床 生交叉耐药，对其进行了体外酶学实验及分子模拟 研究的整合酶链转移抑$1j~jl(integrasestrandtransfer 方面的一些研究后[13151，发现此突变还对其他一些 inhibitor，INSTI)类药物，后由于其在人体 内的关 键代谢产物不稳定而产生毒性，于 2005年终止临 国家 自然科学基金资助项 目21173014，国 床 实验 ．2007年 ，Raltegravir(RAY，商 品名 家重点基础研究发展计划 (973)资助项 目(2009CB930203)，科技部 Isentress，曾用名MK-0518)被美国FDA批准上市， 国际合 作 资助项 目(2010DFA31710)和北 京 市教委 面上 项 目 是第一个上市的此类药物．2012年，FDA批准了 (KM201310005030)．