比利时橡木中伪伞滑刃线虫的鉴定.pdfVIP

圈 澎江右 矸学 2007年第6期 比利时橡木中伪伞滑刃线虫的鉴定 王立红 ，顾建锋 ，张慧丽 ，郑 炜 (1．浙江大学农业与生物技术学院，浙江杭州 310029；2，宁波出入境检验检疫局．浙江宁波 315012) 摘 要：宁波出入境检验检疫局植检实验室在 1份来自比利时的橡木原木中截获一种伞滑刃线虫，经形态 学观察、测量，PCR—RFLP方法确认，鉴定为伪伞滑刃线虫 (Bursaphelenchusfraudulentus Rtihm)。该线虫属松材线 虫组，在比利时和我国尚无记载。该线虫的主要鉴定特征是雌虫尾圆锥形，渐尖，尾长约肛门处体宽的3倍； 端生尾尖突多数弯向腹面，长约2 ktm；雄虫交合刺长约27 m，交合伞呈平铲形或圆铲形。 关键词：橡木；伪伞滑刃线虫；鉴定；PCR—RFLP 中图分类号：$436．67 文献标识码： 文章编号：0528．9o17(20o7)06．0698—04 2006年6月，宁波出入境检验检疫局植检实 下自然挥发3～4周，直到线虫完全脱水。在干净 验室在对宁波某公司从比利时进境的橡木原木实施 载玻片上加上封片蜡圈，用挑针加1滴甘油于蜡圈 检疫时，分离到一种伞滑刃属线虫，经形态学观 中心，在解剖镜下挑取脱水后的目标线虫于甘油 察、测量，以及PCR—RFLP方法确认，鉴定为伪 中，使线虫沉于中心位置。在蜡圈上放置盖玻片， 伞滑刃线虫 (Bursaphelenchus[raudulentus Rtihm)…， 转移至控温电热平板上，保持65cC使蜡完全融化， 这是宁波口岸首次截获该线虫。该线虫形态与松材 自然冷却后用透明指甲油加封一次。 线虫、拟松材线虫等十分接近，目前尚未在我国分 1．2．4 线虫种类鉴定 布，现将鉴定结果报道如下。 用Zeiss Axioskop 40显微镜和Leica DFC 320数 码相机对线虫的整体形态和内部特征进行观察、摄 1 材料与方法 影，并用De Man公式法进行形态特征测计。根据 1．1 样本采集 形态特征和测计结果，结合相关文献，对该线虫种 用锯子将该批木质包装数块锯成小段，编号后 类进行鉴定。 用塑料袋密封，标记，带回实验室检测。 1．3 近似种比较研究 1．2 线虫分离、培养、形态鉴定 对截获的线虫与其他松材线虫组近似种进行形 1．2．1 线虫分离 态学比较研究。 采用改良漏斗法进行线虫分离。将木样劈成长 1．4 PCR-R玎 研究 100 mm、宽10 mm左右的薄片，置于漏斗中，加入 1．4．1 线虫DNA提取 适量水 (以盖没薄片为宜)，25cC恒温培养24 h 取一干净载玻片，上滴 15 l左右的 ddH：0， 后，用表面皿接取5～10 flll线虫分离液，镜检。 挑取 1～5条线虫放入其中，用洁净的解剖刀将线 1．2．2 线虫纯培养 虫切成2～3段，然后吸取含有这些线虫片断的悬 将30余条线虫挑入无菌蒸馏水中漂洗 3次， 浮液 10 l，加入含有 8 l预冷 WLB液的 1．5 ml 移入长满灰葡萄孢 (Botrytis cinema)的PDA培养 Eppendorf管中，并向管中加入2 ttl 600~s／ml蛋白 基中。10 d后，繁殖获得大量的线虫。 酶K，编号标记后放入一70~C冷藏箱低温冷冻数小 1．2．3 永久玻片制作