代谢组学血浆样品前处理及其快速高分辨液相色谱质谱分析方法探究.docVIP

代谢组学血浆样品前处理及其快速高分辨液相色谱?质谱分析方法探究摘 要 采用快速高分辨液相色谱?质谱联用技术，对代谢组学研究中血浆样品的前处理方法进行了考察及优化，建立了用于血浆中小分子代谢物分析的前处理方法。通过考察有机溶剂沉淀蛋白（不同溶剂系统）和固相萃取（Solid phase extraction, SPE）两种方法对血浆中蛋白质去除程度及16个代表性化合物的提取效果，确定采用乙腈沉淀蛋白法；进一步对乙腈沉淀蛋白法进行了细致的优化，确定使用3倍体积的冷藏乙腈慢速沉淀可以达到最佳的处理效果。对血浆中10种代表性化合物进行了方法学考察，结果表明，本方法重现性、精密度及样品冻融稳定性均良好。对穿插在检测序列中的生物质控样本检测结果进行主成分分析（Principal component analysis, PCA），证明本方法在代谢组学研究中的可重复性及获得的数据的可靠性良好，适用于代谢组学研究 关键词 代谢组学； 血浆前处理方法； 快速高分辨液相色谱?质谱联用技术? 1 引 言 ? 代谢组学是研究生物体内源性代谢物的整体及其变化规律的科学??[1～4]?，作为系统生物学的重要组成部分得到了迅速发展，并在制药、药物毒理等领域得到了成功应用??[5～9]?。人体血浆作为代谢组学研究中的重要体液样本，其中含有2000多种内源性小分子代谢物??[10]?，与常见的尿液样本相比，前处理过程相对复杂。首先，由于含有大量的蛋白质类成分，因此进行HPLC?MS分析前需要去除蛋白质；其次，由于血浆中所含成分种类繁多、极性跨度很大，既有高极性的氨基酸、葡萄糖、核苷类等，也有低极性的脂类、固醇类等代谢物。代谢物成分的复杂性增加了血浆样品分析的难度与挑战??[11]?。本研究采用快速高分辨液相色谱?质谱联用技术（Rapid resolution liquid chromatography?mass spectrometry, RRLC?MS）技术，针对血浆样品前处理中常用的有机溶剂沉淀蛋白法与固相萃取方法进行了比较，并进行了方法优化及方法学考察；采用主成分分析（Principal component analysis, PCA）对穿插在检测序列中的质量控制（Quality ?control?, QC）样品数据进行统计分析，最终建立了适合于代谢组学研究的血浆样品前处理方法 2 实验部分? 2.1 仪器与试剂? Agilent 1200 Series RRLC system（德国Waldbronn Aglient Technologies 公司）；QTRAP??TM?四极杆?线性离子阱串联质谱仪（美国Applied Biosystems/MDS SCIEX公司），配有ESI源和Analyst QS 1.5数据处理系统； 乙腈、甲醇、乙醇、丙酮和甲酸（色谱纯, Merck公司）；标准品分别购自Fluka公司、Sigma?Aldrich公司及中国药品生物制品检定所；实验用水为超纯水。? 人血浆样品（EDTA抗凝），采自中国医学科学院北京协和医院，采集后立即于－80 ℃冷冻保存。? 2.2 色谱条件? Zorbax Aq?C??18? 色谱柱 （100 mm×2.1 mm×1.8 ?SymbolmA@ m; 美国Agilent公司） ；流动相：A为H?2O（含0.1% formic acid）; B为CH?3CN。线性梯度洗脱：0～20 min，0～100% B；20～23 min，100% B。每次进样前，色谱柱在初始流动相条件下平衡8 min，流速 250 ?SymbolmA@ L/min。柱温 60 ℃；进样量 5 ?SymbolmA@ L。? 2.3 质谱条件? ESI离子源，分别采用正、负离子EMS扫描模式，喷雾电压为5500～4500 V，解簇电压（DP）为50～?－50 V?，源温度375 ℃，雾化气为7.5 MPa，干燥气为 6.5 MPa，气帘气为4.0 MPa，扫描范围为65～?850 Da?。数据采集和处理采用Analyst 1.5数据处理系统。? ? ??分 析 化 学??第39卷? ?第12期??徐 婧等： 代谢组学血浆样品前处理及其快速高分辨液相色谱?质谱分析方法研究?? ? 2.4 标准品及样品的制备? （1）标准品溶液1 肌酐（Creatinine，Crea）、L?半胱氨酸（L?Cysteine，Cys）、L?异亮氨酸（L?Isoleucine，Ile）、马尿酸（Hippuric acid，HA）、葡萄糖（Glucose，Gl）、L?酪氨酸（L?Tyrosine，Tyr）、犬尿烯酸（Kynurenic acid，KA）、