分子与基因工程实验七.pptVIP

Transformation frequency Independent transgenic plants/inoculated immature embryo or callus. Line The seedlings from one transgenic cell, namely, one independent successfully transformation event, belong to one line, also are called clones. Generation These transgenic seedlings are T0 generation seedlings, T0 generation mature seeds are T1 generation…Meiosis or pollination is the boundary of different generations. 实验七 农杆菌介导的叶盘法转化 目的及要求： 通过叶盘法将带有报告基因的农杆菌转入烟草中，诱导获得转基因植株。 了解农杆菌转化植物的原理，掌握农杆菌的培养和侵染植物的方法。 二、实验原理 农杆菌重组子中携带经改造的Ti 质粒（含有帮助T-DNA跳到植物染色体上的Vir 区）和包含T-DNA的双元载体pBinGUS，质粒pBinGUS上T-DNA上插入了报告基因（GUS）和卡那霉素筛选标记基因NPTII。 叶盘法转化是通过人为在烟草叶片上产生伤口，侵染时农杆菌吸附于植物的表面伤口部位，受伤后双子叶植物分泌的酚类化合物透过农杆菌的细胞膜，活化vir区基因，vir区基因的活化，促使T-DNA进行加工和转移。T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上。共培养可使T-DNA上携带的编码抗生素的抗性基因得到表达，因此，转化了的烟草外植体可在含有相应抗生素的培养基上生长。 植物基因转化受体系统 指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。 具备条件： （1）高效稳定的再生能力 （2）较高的遗传稳定性 （3）具有稳定的外植体来源 （4）对选择性抗生素敏感 （5）对农杆菌侵染有敏感性 外植体的种类 叶片、叶柄、子叶、子叶柄 茎、花茎、块茎、茎尖分生组织 根 合子胚 成熟种子 叶盘法转化 双子叶植物 以叶片作为外植体，在叶片上产生伤口，侵染时农杆菌吸附于植物的表面伤口部位; 受伤后双子叶植物分泌的酚类化合物透过农杆菌的细胞膜，活化vir区基因，vir区基因的活化，促使T-DNA进行加工和转移。T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上。 农杆菌与外植体共培养 接种菌体后的外植体培养在诱导愈伤组织的固体培养基上，在外植体细胞分裂、生长的同时，农杆菌在外植体切口面也增殖生长，该两者共同培养过程称之为共培养。 是整个转化过程中非常重要的环节。因为农杆菌吸附，T-DNA的转移及整合都在这共培养时期内完成。 Events An event is the insertion of a particular transgene into a specific location on a chromosome. Conceptions 实验仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，培养箱，台式离心机，培养皿，加样器 及吸头，无菌滤纸； 材料：携带质粒植物表达(pBI121)载体土壤农杆菌LBA4404 烟草无菌苗 试剂： YEB液体培养基（1升）： 酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0 MS盐： MS大量元素、微量元素、pH7.0； MS基本培养基： MS大量元素、微量元素、有机物， 3%蔗糖，0.8 %琼脂，pH5.8； 实验步骤 1. 从平板上挑取含有pBI121的农杆菌LBA4404单菌落，接种于50ml YEB液体培养液(含有100mg/L Kan和125mg/L Sm)中，28°C振荡培养至OD600为0.6-0.8； 2. 4000rpm，室温离心10分钟，倒掉上清. 3. 用MS盐溶液（pH7.0）重新悬浮菌体，侵染时采用MS盐溶液稀释至原体积的20-50倍。 4. 在超净台上从烟草无菌苗上切下叶片,切去边缘和主要叶脉，切成0.4×0.6cm2大小； 5. 侵染：将切好的外植体在农杆菌菌液中浸