分光光度计测定大曲中糖化酶活性.ppt

分光光度法测定大曲糖化酶活力探讨 丁海艳 阅 大曲中糖化酶 大曲中的微生物群比较复杂，主要有霉菌、酵母菌和细菌等，这些微生物可以分泌很多胞外酶，真正起糖化作用的是葡萄糖淀粉酶 (Glucoamylase，EC3．2．1．3)简称糖化酶，是一种外切型糖苷酶，它从淀粉的非还原性末端依次水解 α一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像 β一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成 β一D葡萄糖。当遇到支链淀粉的分支点时，它也可以水解 α一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也 能微弱水解 α一1，3糖苷键，它一般都能将淀粉百分之百地 水解生成葡萄糖。 我国大多采用次碘酸盐法测定糖化酶活力方法存在速度慢，操作繁琐等缺 点，本文研究利用分光光度计测量 3，5一二硝基水杨酸与还 原糖显色反应的吸光度值，并根据吸光度值 与还原糖含量的相关关系确定糖化酶活力，以期找到一种快速、准确测定大曲糖化酶活力的方法。 实验方法 糖化酶活力测定原理 酶活力定义 ：1g酶液在 40℃、pH4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产lmg葡萄糖的酶量定义为 1个酶活力单位。 测定原理：淀粉经糖化酶水解为葡萄糖，3，5一二硝基水杨酸 (DNs)与葡萄糖共热后被还原成棕红色的 3一氨基一5硝基水杨酸，在波长 520nm 处，3一氨基-5硝基水杨酸有强的光吸收。在一定浓度范围内，反应液的吸光度值与葡萄糖的量呈正比，即反应液的吸光度值与糖化酶活力成正比。 标准曲线制作： 准确称取酶活为 861.9U／g的大曲 1.6g，定容至 25mL 容量瓶中。取 6个 50mL比色管，分别加入 2％淀粉溶液 25mL，0.1mol／L乙酸 -乙酸钠缓冲液 5mL，蒸馏水2.0mL、 1.6mL．1.2mL．0.8mL、0.4mL、0mL，摇匀，40℃水浴5min。 依次加入液体糖化酶稀释液 0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、 1.6mL、2.0mL到比色管中，立即计时，反应 30min。分别向 比色管中添加20％NaOH0.2mL，迅速用水冷却，终止酶反应。 分别取 5mL反应液，用蒸馏水定容至 100mL，取 0.5mL 稀释反应液到试管中，加入 0．5mL DNS，沸水浴 3min。分 别向试管中加 8mL蒸馏水，在波长 520nm 处比色。 大曲糖化酶活力测定 糖化液、空白液的反应方法和国标一样，就后面测定方法不一样。 测定方法：分别取 5mL反应液（糖化液、空白液），用蒸馏水定容至 100mL，取 0.5mL 稀释反应液到试管中，加入 0.5mL DNS，沸水浴 3min。分别向试管中加 8mL蒸馏水，在波长520nm 处比色。根据样品吸光度值在标准曲线上查出对应的糖化酶活力。 结果与讨论 不同浓度葡萄糖溶液与DNS共热后的吸光度值见表 1。以酶活力为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线见附图。 由附图可知，在一定酶浓度范围内，反应液的吸光值与糖化酶活力成正比，其关系式为：Y=0．000630X(式中x为糖化酶活力：Y为吸光度值)。 表 1不同酶活力的吸光度值 加标回收 向样品中加入 lg已知酶活为 861．9U／g的大曲， 反应测定糖化酶酶活力的变化，结果见表 2 由表 2可知，用分光光度法测定糖化酶酶活加标回收 率为 95.0%-105%，相对标准偏差1.045％，符合分析 方法中的规定。 表 2 糖化酶酶活力的回收率 对照实验 取 1g活力为 861.9U／g的酶液，分别用分光光度计法和碘量法测定糖化酶活力，结果见表 3。 由表3可知，分光度计法与碘量法测定的精确度基本相当。 结论 实验表明，糖化酶水解淀粉产生的葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸 (DNs)反应生成的棕红色 3-氨基 5-硝基水杨酸，在 520nm 波长处的光吸收强度与糖化酶活力呈正比，可采用分光光度计法测量大曲的糖化酶活力。 当吸光度值为 0．2～0．5时，实验误差1％。分光光度计法与碘量法测定大曲糖化酶活力的精度基本相当，但分光光度计法比碘量法步骤少，操作简单，可以实现快速测定。