两侧有聚酰胺膜色谱-氨基酸.ppt

DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析 薄层层析（Thin-layer chromatography,TLC) 薄层层析 ---是吸附剂在平滑的玻璃板或聚脂薄膜上铺成薄层作为固定相，以溶剂作为流动相，将样品中各组分分离的方法。 分离原理： ——吸附层析 吸附层析的概念及原理 吸附 ---一种物质被聚集在另一种物质表面的现象。 吸附剂： ---凡是能够将其他物质聚集到本身分子表面的物质称为吸附剂，如氧化铝、硅胶等。 被吸附物 ---聚集在吸附剂表面的分子就称为被吸附物。 吸附层析（Absorption Chromatography) 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心,利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离. 吸附剂 主要是利用吸附剂对不同物质吸附力的不同而达到分离的目的。 薄层层析中吸附剂选择是关键。 吸附剂的选择 （1）应不溶于所使用的溶剂;与所使用的溶剂和样品中各组分不起化学反应； （2）应具有较大的吸附表面（吸附容量）和一定的吸附力;对被分离个组分有不同的吸附力,有足够的分辨力； （3）吸附剂颗粒大小要均匀，保持良好的重复性。 吸附剂的吸附能力 常称为活度，用罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表示。 活度 强 弱 含水量 多 少 常用吸附剂 极性： 硅胶: 为首选吸附剂。本身具微酸性，适用于分离酸性及中性物质。 氧化铝: 氧化铝具有分离能力强、活性可以控制等优点 碱性/中性/酸性氧化铝 …… 非极性： 纤维素 聚酰胺： →合成：己二酸、己二胺 →特点：氢键吸附剂 …… 聚酰胺 聚酰胺对极性物质的吸附作用 ——是由于聚酰胺的-C＝O(羰基)及NH(氨基)能与被分离物质之间形成氢键。 如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类（如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键 如硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键 被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。 在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离. 溶剂 不同溶剂具有不同的结构性质，依极性大小各种溶剂的洗脱能力各不相同。 一般所选溶剂要求： a.纯度合格 b.黏度要小→易与样品中各组分相分离 c.与所欲分离样品和吸附剂不起化学反应 溶剂选择考虑因素 1、溶剂与吸附剂之间的相互作用力 2、溶剂与样品之间的作用因素 溶剂的选择可通过实验来确定。 薄层层析的操作 1、点样 样品最好溶解在挥发性的溶剂中，如氯仿、丙酮等，避免用水每次点少量样品，可在溶剂挥发后反复进行至点完为止。 样品原点直径＜3mm 2.平衡 3.展开 方法： 上行层析法 下行层析法 双向展开法 显色 1）有色物质（如黄体酮）展开后即可显出斑点 2）紫外灯下显出荧光斑点，如核苷酸和某些生物碱 3）显色剂显色 荧光试剂 ——DNS-Cl二甲氨基萘磺酰氯 蛋白质、多肽、氨基酸可与其游离氨基结合 DNS-aa发出黄绿色荧光 DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光 DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光 →可彼此区分。 三、薄层层析的应用 （一）定性分析：将已知化合物作为标准品与样品一起进行层析后对照，可初步确定未知化合物的组成。 （二）定量分析：可直接在薄板上测定，无须破坏薄层； 用工具将斑点从薄层上取下，用溶剂洗脱，再用其他方法测定。 临床生化上的应用 1.氨基酸的分离 2.核苷、核苷酸和核酸的分析 DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析 二甲氨基萘磺酰氯 (1-Dimethylaminonaphtalene-5-sulfonyl chloride，DNS-Cl)可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨基酸。 形成的DNS-氨基酸在紫外线（260nm或365nm）照射下发出强烈的黄色荧光，因此可用荧光检测DNS-氨基酸的存在。 本实验中，聚酰胺上胺基与氨基酸的羰基形成氢键，酰胺基团上羰基与AA中羟基或酚基形成氢键。由于有些AA结构相似，如只采用一种溶剂系统进行单向层析，难达到完全分离的目的。因此可选择另一溶剂系统进行第二向层析。 第一向——苯－冰醋酸 第二向——甲酸－水 显色 二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基酸在紫外光下呈黄绿色荧光。 DNS-Cl + AA DNS-AA + HCl DNS-氨基酸的双向层析图谱 操作以及注意事项 注意 Pro