高等植物花启动基因调控研究 - 华中师范大学.ppt

分子生物学实验 实验目录 实验 一 植物基因组DNA提取及纯化 实验 二 PCR克隆目的基因 实验 三 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 实验 四 PCR产物凝胶回收 实验 五 目的基因片段与载体连接 实验 六 E.coli DH5α和 DE3感受态细胞制备 实验 七 连接产物转化转化大肠杆菌 实验 八 阳性单菌落筛选 实验 九 重组质粒DNA提取 实验 十 重组质粒及表达载体pET酶切分析与电泳 实验十一 目的片段回收及与表达载体连接 实验十二 连接产物转化DH5α,质粒提取 实验十三 阳性质粒转化表达菌株BL21 实验十四 蛋白质的诱导表达及蛋白质样品制备 实验十五 SDS检测诱导表达的蛋白质 实验一 植物基因组DNA提取 基本原理 1. 基因组DNA 的提取通常用于构建基因组文库、Southern 杂交及PCR 分离基因等。 2.不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA 的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。 3. 在提取某种特殊组织的DNA 时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA 大分子。尤其是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA 时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 4.核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸通常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为DNA和RNA，在真核生物中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质和核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。 5. 植物基因组DNA的提取程序： （1）破碎组织 （2）破坏细胞膜 （3）去除杂质 （4）沉淀基因组DNA 本实验是通过SDS法提取拟南芥基因组DNA。 二 实验目的 1.通过SDS提取拟南芥基因组DNA; 2.为从拟南芥基因组DNA克隆目的基因作准备 仪器、材料和试剂 仪器及耗材： 研钵、微量移液器及吸头、EP管、台式离心机。 材 料： 拟南芥小苗 试 剂： DNA Extract Buffer (0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5); 70%乙醇；酚；氯仿；异丙醇;RNase 实验步骤 9.在溶解DNA中加入3-5μl RNase，37oC消化2-3h; 10.补充ddH2O至总体积400μl，加入等体积的酚/氯仿，混匀； 11. 12000 rpm, 5min (RT)，取上清入新的EP管中，用等体积的氯仿再抽提一次,12000 rpm, 5min (RT) ； 12. 取上清，加入1/10体积的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，并混匀，-20oC 放置10 min; 13. 12000 rpm, 10min ,4oC； 14.去上清，70％乙醇洗沉淀,12000 rpm, 5min ,4oC ； 15.去上清，沉淀干燥后，加入 ddH2O溶解DNA 16. 通过分光光度计或电泳检测DNA的浓度和纯度。 注意事项 （1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 （2）植物组织充分匀浆。 （3）DNA的二级结构和双链易受多种因素的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。 （4）抑制内外源DNase的活力。 （5）防止化学降解。 （6）防止物理因素降解。。 实验报告 实验二 PCR克隆目的基因 一 实验原理 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)是一种选择性体外扩增DNA 的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(56℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对; (3) 延伸(Extension):在TaqDNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进行合成. 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35 轮循环就可使DNA 扩增达待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR技术发展 PCR是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目