AFLP技术的基本原理.doc

AFLP 技术的基本原理与实验方法 AFLP 技术的基本原理: AFLP 技术是一项新的分子标记技术，其原理是：基因组DNA经过二种酶不同的限制性内切酶酶切后，产生粘性末端，再使用连接酶将人工合成的双链接头连接在酶切位点的粘性末端。接头一端具有与内切酶同样的识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板进行预扩增。接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。引物由3部分组成: ①核心碱基序列，该碱基序列与人工接头互补；②特异性酶切序列；③引物3’端选择性碱基。选择性碱基延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。另外，通过选择在末端分别添加了1～3个选择性核苷酸的不同引物，可以达到选择扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物选择性地识别具有特异配对序列的内切酶酶切片段。并与之结合，实现特异性扩增。 实验方法: DNA 酶切 AFLP技术成功的关键在于DNA的充分酶切,所以对模板质量要求较高,在DNA完全溶解后利用紫外分光光度仪测定DNA浓度，将DNA浓度用双蒸水调整到50ng/ul,应避免其他DNA污染和抑制物质的存在。 表1：E-M酶切体系 反应体系（E-M组合） 1/2倍 1倍 DNA（50ng/ul） 1.50ul 3.0 ul EcoRⅠ(10u/ ul) 0.25ul 0.5 ul MseⅠ (10u/ ul) 0.15ul 0.3 ul Tango Buffer (10×) 2.50ul 5.0 ul ddH2O 8.10ul 16.2 ul 总体积 12.5ul 25 ul 表2：P-M酶切体系 反应体系（P-M组合） 1/2倍 1倍 DNA（50ng/ul） 1.50ul 3.0 ul PstⅠ(10u/ ul) 0.25ul 0.5 ul MseⅠ (10u/ ul) 0.15ul 0.3 ul Buffer R (10×) 1.25ul 2.5 ul ddH2O 9.35ul 18.7 ul 总体积 12.5ul 25 ul 表3：P-T酶切体系 反应体系（P-T组合） 1/2倍 1倍 DNA（50ng/ul） 1.50ul 3.0 ul TaqⅠ(10u/ ul) 0.15ul 0.3 ul PstⅠ (10u/ ul) 0.5ul 1.0 ul Buffer Taq (10×) 1.25ul 2.5 ul ddH2O 9.10ul 18.2 ul 总体积 12.5ul 25 ul 表4：E-T酶切体系 反应体系（E-T组合） 1/2倍 1倍 DNA（50ng/ul） 1.50ul 3.0 ul TaqⅠ(10u/ ul) 0.3ul 0.6 ul EcoRⅠ(10u/ ul) 0.25ul 0.5 ul Buffer Taq (10×) 1.25ul 2.5 ul ddH2O 9.20ul 18.4 ul 总体积 12.5ul 25 ul 表5：M-S酶切体系 反应体系（M-S组合） 1/2倍 1倍 DNA（50ng/ul） 1.50ul 3.0 ul SacⅠ(10u/ ul) 0.5ul 1.0 ul MseⅠ (10u/ ul) 0.3ul 0.6 ul Tango Buffer (10×) 1.25ul 2.5 ul ddH2O 8.95ul 19.9 ul 总体积 12.5ul 25 ul 表6：T-S酶切体系 反应体系（T-S组合） 1/2倍 1倍 DNA（50ng/ul） 1.50ul 3.0 ul SacⅠ(10u/ ul) 0.25ul 0.5 ul TaqⅠ(10u/ ul) 0.3ul 0.6 ul Buffer SacⅠ(10×) 1.25ul 2.5 ul ddH2O 9.2ul 18.4 ul 总体积 12.5ul 25 ul  表7：常用内切酶酶切位点、最适温度、接头名称和预扩引物 内切酶 酶切位点 最适反应温度 接头名称 预扩引物 选扩引物 EcoRⅠ G↓AATTC CTTAA↓G 37℃ Ead EA EC EA01－EA16 EC01－EC16 MseⅠ T↓TA A AAT↓T 65℃ Mad MC MG MC01-MC16 MG01-MG16 PstⅠ CTGCA↓G G↓ACGTC 37℃ Pad P0 P001- P016 TaqⅠ T↓CGA AGC↓T 65℃ Tad TC TG TC01-TC16 TG01-TG16 SacⅠ GAGCT↓C C↓TCGAG 37℃ Sad SA SA01-SA16 ※先将模板吸入PCR板中，再将内切酶、Buffer、双蒸水配制为Mix（因内切酶用量很少或者因少数枪头质量