产淀粉酶菌种的分离.docx

产淀粉酶菌种的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化一．设计背景淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，是用于酿酒、食品、医药、纺织、饲料等具有商业价值的重要酶类。是最早实现工业化生产，迄今为止用途最广，产量最大的酶制剂品种。所以开始产淀粉酶菌种的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化。目的要求 分离筛选出产淀粉酶菌种，并进行鉴定和产酶条件的优化实验技术步骤及详细流程采集含菌样品 设计配制选择性培养基 分装灭菌 平板涂布分离纯化菌种（透明圈法） 划线分离进一步纯化产酶菌种（透明圈法） 液体培养法复筛产酶菌种，检测产酶性能 目的菌种斜面和甘油保藏 目的菌种的染色法显微观察 目的菌种的常规生理生化鉴定 考察紫外线对产酶菌种生长及产酶性能的诱变效应 考察碳源或氮源种类及浓度对产酶菌种生长及产酶性能的影响 考察PH对产酶菌种生长及产酶性能的影响采集含菌样品 根据所选产酶菌种的要求，我们宜在淀粉制品霉变的样品中分离。故在新校区的花坛中提前一周埋入淀粉制品（距离地表5cm左右），一周后用小铁勺在新校区的花坛中挖出泥土，放入提前准备好的塑料袋中。培养基的配制2.1 平板筛选培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%,可溶性淀粉2．0％，琼脂1．5～2．0％，pH自然。121℃灭菌20min。2.2 摇瓶复筛培养基：玉米粉3％，玉米浆3％，CaCl20．13％， Na2HP04 0．3％，(NH4)2S04 0．4％，pH 6．0。121℃灭菌20min。 2.3 斜面保存培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0～20.0g，加蒸馏水至1000ml。pH7.0～7.2。 2.4 种子培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0～20.0g，加蒸馏水至1000ml。pH7.0～7.2。 2.5 产酶液体培养基：玉米粉3％，玉米浆3％，CaCl20．13％， Na2HP04 0．3％，(NH4)2S04 0．4％，pH 6．0。121℃灭菌20min。分装灭菌将所需要灭菌的仪器，如培养皿，锥形瓶，试管，移液管灭菌，使用加压蒸汽灭菌法。一般使温度升高到121摄氏度，高温加压20Mmin。平板涂布分离纯化菌种（透明圈法）称取土壤样品1g溶于9mL无菌水中，将水样品5mL溶于 45mL无菌水中，分别用无菌水梯度稀释至1×107倍，取1×105、1×106、1×107稀释液涂布于平板筛选培养基表面。37摄氏度培养72h，用无菌的牙签挑选单菌落影印2-3皿，同时用签字笔对各单菌落标号。影印过的培养皿37℃培养72h，取其中一皿喷洒稀碘液记录有水解圈的单菌落。根据记录从剩余2皿中挑取对应有透明圈的单菌落，转接，经平板划线法得到纯种。接种斜面保存培养基中，培养后于4℃保藏。5.划线分离进一步纯化产酶菌种（透明圈法）将初筛得到的菌种涂布于平板筛选培养基表面。依然37摄氏度培养72h，用无菌的牙签挑选单菌落影印2-3皿，同时用签字笔对各单菌落标号。影印过的培养皿37℃培养72h，取其中一皿喷洒稀碘液记录有水解圈的单菌落。挑取有透明圈的单菌落，转接，经平板划线法得到纯种。通过复筛，划线分离进一步纯化产酶菌种，接种斜面保存培养基中，培养后，于4℃冰箱保藏。6.液体培养法复筛产酶菌种，检测产酶性能6.1 复筛得到的纯菌种接种于30／250mL种子培养基，37摄氏度、250r／min 摇床培养过夜。种子液以2％接种量接种于产酶液体培养基 50／500mL，相同条件培养72h，发酵液8 000r／min离心10min，取上清液测酶活，每个样品重复3次，最后结果取平均值。 6.2 酶活测定方法 测定方法：3，5一二硝基水杨酸比色法。 标准梯度糖液配制，?分别取0.5mg/ml的葡萄糖标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于1~6号试管中，并用蒸馏水补足到1ml。?2.还原糖液的提取?，精确称取样品1.0g于100ml小烧杯中，再加入50ml蒸馏水搅匀，用水定容到100ml。?3.过滤，取滤液1ml于7、8号试管中，待用。????4.称取样品1.0g，放入100ml小烧杯中。加入10ml?6mol/L的HCl，和15ml蒸馏水，沸水浴加热25min.??用胶头滴管滴2~3滴碘化钾—碘溶液于培养皿中（可以稍微稀释），用细玻璃棒 蘸少量样品与之进行反应，若无深蓝色物质产生说明总糖已经水解完全，否则继续沸水浴加热并每隔5min以相同的方法再次测定，直至完全水解。5.取出完全水解的样品，冷却后滴加2~3滴酚酞，用