HB-infusion无缝克隆试剂盒使用说明.pdfVIP

HB-infusionTM 无缝克隆试剂盒使用说明 一、产品简介 HB-infusionTM 无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA 定 向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。HB-infusionTM 无缝 克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物的 5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp 同源序列（图1，图3 ）。将上述线性化 的克隆载体和带有同源序列的PCR 片段按合适比例混合，并加入HB-infusionTM Master mix ， 通过反应体系中DNA 外切酶、DNA 聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min 即可快速完成 定向克隆，阳性率几近100%。 图1. HB-infusionTM 快速克隆试剂盒原理示意图。1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR 获取目的片段。设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp 的重叠（图中蓝色和黄 色片段，细节可参考图3 ）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusionTM 的2预混液内， 50C 反应20 min 后直接转化E.coli 即可。 二、HB-infusionTM 试剂盒的优点 1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusionTM 试剂盒更高效，操作更简单， 只需要一次反应即可完成定向克隆； 2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点； 3. 连接片段之间不会引入任何其他序列； 4. 可以同时克隆多个片段。 三、产品包装 产品组成 使用次数 体积 2 x HB-infusionTM Master mix 20 tests 200 l Positive linearized pUC vector （250 ng ） 5 tests 25 l Positive control insert (500 ng) 5 tests 25 l 储存条件 -20 ℃ 四、使用说明 汉恒生物建议2-3 个片段连接时，DNA 片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6 片段连 接时加入的DNA 总量为0.2~1.0 pmols 。DNA 拼接效率随着拼接片段的数量增加或者拼接 片段长度的增加逐渐降低。 附：片段摩尔数量计算公式： pmols=片段质量(ng)1000/(碱基对数650 daltons)（碱基数越多，pmols 越少；质量越大， pmols 越多），举例如下： 线性化载体（~5000 bp ） 50 ng 插入片段（~500 bp ） 10~25 ng 注：50 ng 的5000 bp （0.015 pmols）的线性化dsDNA 和10~25 ng （0.03~0.075 pmols） 500 bp 的PCR 产物体系（PCR 产物和线性化载体的摩尔比=2 ：1~5：1）。 五、操作步骤 1. 制备线性化载体和插入片段 1.1. 载体制备线性化处理 A.质粒酶切法 在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切，对酶切后的载体进行割胶纯化。 注：1. 为了降低载体自连背景，提高阳性率，建议采用双酶切载体质粒。酶切最好 能切出一个较大片段，这样回收的目的条带可以和没有切开的质粒明显分开。 2. 质粒单酶切容易造成载体切割不完全和自连，导致假阳性的产生。因此，必须 单酶切的时候建议延长酶切时间并脱磷处理（酶切2h-过夜，CIP 处理20 min ），同时做好 空载的对照。 3. 请务必跑胶回收线性化的载体，否则非线性化质粒会带来极高的背景。 4. 一种特殊情况：如果采用双酶切彻底线性化载体，而插入片段又没有双酶切的 识别位点，也可以跳过纯化步骤，只需热失活内