双向电泳技术.pptVIP

*1809年俄国物理学家Peйce首次发现电泳现象。*1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。*1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。*1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。*从上世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。*1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。?*由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。*双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1000个E.coli蛋白。 第一节 蛋白质电泳的基本原理 一、电泳的基本原理 1、在电场作用下，带电颗粒向着与其电性相反的方向移动的现象称为电泳（electrophoresis)。 由F = Eq，f = 6πr υ η 可得υ=Eq/(6πr η) 2、带电颗粒的泳动速度同电场强度和分子本身所带的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质黏度成反比。 蛋白质是一种两性电解质。其泳动速度取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量以及颗粒的大小和形状。 二、影响电泳速度的因素 1、电场强度；2、缓冲溶液的pH；3、缓冲溶液的离子强度；4、电渗；5、焦耳热 三、电泳的分类 按原理分类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 稳态电泳（或称置换电泳）：分子颗粒的电泳迁移在一定时间达到一个稳态后，带的宽度不随时间而变化。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。 ③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。 ④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。 ?? 另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、板电泳、柱电泳。?? 根据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量电泳、免疫电泳。 按pH的连续性不同，可分为：连续pH电泳，不连续pH电泳。 四、聚丙烯酰胺凝胶电泳 第二节 蛋白质等电聚焦电泳 1966年，瑞典科学家Rible和Vesterberg建立。 等电聚焦：isoelectric focusing,IEF。 1.电泳系统中加进两性电解质载体，当通直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。蛋白进入时，不同的蛋白移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的蛋白得以分离。 2.优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定蛋白或多肽的等电点。 3.缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白。 利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的（或非线性）pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。分析对象只限于蛋白质和其他两性分子。 根据建立pH梯度原理不同，可分为载体两性电解质pH梯度（carrier ampholyte pH gradient)和固相pH梯度(immobilized pH gradient, IPG)。 一、基本原理 1、蛋白质的等电点：取决于其氨基酸的组成。 组成每一种蛋白质或多肽的氨基酸的数目和比例是不同的，故蛋白质的等电点范围很宽，这使得可以利用它来分