分子生物学第四章第三节.ppt

第三节 复制的起始 所有已知的DNA分子都在复制起点处起始一轮复制。 DNA复制是在起始阶段进行控制的，复制子增殖依赖于起始过程中在起点处发生的相互作用。一旦起始后，它就会进行到底，直到整个基因组都复制完成。 一个细胞周期中，每个复制子只启动一次。 DNA复制起始有两种方式： 从头起始（de novo initiation） DNA链的合成从头开始 共价延伸（covalent extension） 新链从原有的亲链上开始合成，滚环复制就是通过共价延伸起始的。 DNA双螺旋复制的从头起始包括 以下连续的步骤(大肠杆菌)： 预引发体的形成 复制复合物的改型 引发体的形成 复制体的组装 一、预引发体的形成 预引发体的组分包括： 起始蛋白: 专一性识别起点序列的蛋白质 参与组装过程的蛋白质 这些蛋白质在随后的DNA合成中往往不发挥作用，如装载因子和改型因子等。 复制机器的组分，如DNA螺旋酶 这些因子共同作用控制复制叉组装的时间和位点，它们还作为细胞周期调控的靶子。 起始因子在原核生物、噬菌体、以及真核生物中功能上是保守的。 大肠杆菌oriC的复制起始需要DnaA、DnaB、DnaC、HU、gyrase（II 型拓扑异构酶）和SSB的参与，它们形成复合物协同作用使双螺旋上出现连续的解旋。 大肠杆菌的起始蛋白是DnaA蛋白，它可以识别复制起点并与之结合，这种结合是随后的起始事件的基础。 大肠杆菌的双向复制起点oriC包括245bp的序列，由9 bp和13 bp重复序列组成。两种重复序列都富含A、T，这是起点发挥功能所需要的。 复制起始区的结构特点是： （1）富含A－T，这可能和双链易于解开起始复制有关； （2）含有多个回文结构（9－14个GATC）8个GATC较保守,GATC中的“ A”已甲基化; （3）具有 4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点； （4）此顺序的右侧毗邻区域有两个启动子，其可能的作用是：①转录产生引物；②产生复制必要的蛋白；③产生调节功能的RNA；④起转录激活作用。 大肠杆菌的复制起点 位于oriC位点右侧的4个9bp的一致序列提供了DnaA的起始结合位点。 一旦DnaA结合DNA，起始蛋白会获得额外的功能： 1.促进DNA解旋或使邻近的DNA发生扭曲使DNA解旋酶能够进入。 2.帮助与复制叉组装和功能相关的其他因子进入。 尽管起始因子结合起点对复制起始是关键的，但这种结合并不足以引发复制的起始。 首先，起始因子的DNA结合位点并不是实际的复制起点。其次，当DnaA结合起点时，起点是不活化的。 因此，起始蛋白结合起点并不是复制起始的决定步骤。 DnaA蛋白作用于oriC左侧的3个13bp的串联重复序列，使3个13bp重复序列的DNA链熔解。 DnaA是ATP结合蛋白，ATP对DNA结合并不是必须的，因为ADP-DnaA蛋白也可以形成起始复合物，但不能打开oriC处的DNA双螺旋。 DnaA除了专一性地识别DNA双链结合位点之外，还能与单链区域的一条链发生专一性的相互作用，作为单链DNA结合蛋白发挥作用。 DnaA结合起点DNA后，将促使参与复制叉组装的其他因子的结合，这个过程的主要目的是促使DnaB进入复制叉的组装位点。 DnaB实际上是使DNA解链的螺旋酶。它能识别复制叉处潜在的单链结构，与DNA旋转酶协同作用，促使大范围的解链。 同时，SSB蛋白稳定形成的单链DNA。 DnaB是一个六聚体蛋白质，与6个DnaC蛋白结合形成DnaB/DnaC复合体。这个复合物与oriC结合形成预引发体，从而形成一个双向的复制叉。 DnaC是DnaB的装载因子，伴随DnaB六聚体结合复制叉组装位点，此外它还使螺旋酶保持无活性的状态。 总之，起始因子与单链DNA的相互作用，以及DnaB/DnaC复合物与起始蛋白DnaA的相互作用对复制叉的组装都是必要的。 二、复制复合物的改型 起始因子在DNA复制起点的组装需要起点结合复合物保持高度的稳定性，但DNA复制却需要起始蛋白－DNA复合物的组分保持自由状态以完成它们的功能。 在复制起始过程中，需要这些复合物改型或去组装以使稳定的起点结合复合物转化为活动的复制机器。 大肠杆菌的DNA复制中，通过改变起始复合物各组分的ATP结合状态来改变其组成形式。其DnaC必须结合ATP才能与DnaB相互作用并装载DnaB，当ATP水解或释放时，DnaC会离开复合物。 起始过程最主要的改型步骤，导致了复制叉处螺旋酶的活化。螺旋酶的活化可能是装载复制叉其他组分的关键步骤。 一旦螺旋酶活化，它将连续熔解双螺旋DNA。 三、引发体的形成 高度解链的模板与蛋白质的复合体促进引发酶（primase）加入来形成引发体（primoso