酶工程04酶的分离纯化资料.ppt

可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙 醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白 质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改 变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物 的短轴长度都一样，约为18A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不 再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。 有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。 不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。这些蛋白质有：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。因此，在分析SDS-凝胶电泳所得的结果时，应该小心。一般至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。为了判断待测样品是否可用SDS-凝胶电泳法来测定分子量，也可以使蛋白质-SDS复合物在不同浓度（交联度相同）的SDS-凝胶中电泳，得到Ferguson图。如果待测样品的自由迁移率m0与标准蛋白质的m0基本交于一点（如图16-3），而且在不同浓度的SDS-凝胶中测得的分子量都相同，则表明此蛋白质在SDS-凝胶电泳中的行为是正常的，可以用SDS-凝胶电泳法测定其分子量。 低分子量标准蛋白试剂盒，中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂生产（表16-2）。表16-2 5种标准蛋白质蛋白质名称Mr磷酸化酶B牛血清蛋白肌动蛋白磷酸酐酶烟草花叶病毒外壳蛋白94 00067 00043 00030 00017 500 ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 固定与染色(1)考马斯亮蓝染色①试剂 a.固定液 称取三氯醋酸5g，加水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加水至500ml。b.染色液 称取考马斯亮蓝R[250]0.5g，加水200ml溶解后，加甲醇200ml与冰醋酸50ml，再加水至500ml。c.脱色液 取甲醇400ml、冰醋酸100ml，加水至1000ml，充分混合。d.保存液 取冰醋酸75ml，加水至1000ml，摇匀。②固定与染色 电泳完毕，取出胶片（条），置固定液中30分钟，取出胶片（条），置染色液中1～2小时，用脱色液脱色至凝胶背景透明后保存在保存液中。 银染色①试剂 a.硝酸银溶液 取硝酸银0.8g，加水至4.0ml，将此溶液滴加到0.1mol/L氢氧化钠溶液20ml与25%氨溶液1.5ml的混合液中，摇匀，用水稀释至100ml。b.固定液 取甲醇50ml、37%甲醛溶液54μl，加水至100ml。c.显色液 取1%枸橼酸溶液2.5ml、37%甲醛溶液270μl，加水至500ml。d.终止液 取冰醋酸100ml，加水至1000ml。②固定与染色 胶片浸在固定液中至少2小时后弃去固定液，用水浸洗至少1小时；胶片置1%戊二醛溶液中15分钟后，用水洗2次，每次15分钟；胶片置硝酸银溶液中15分钟后，用水洗3次，每次15分钟；胶片置显色液中，待各带显出后置终止液中。5.计算 三高效毛细管电泳（HPCE)(略） 四聚焦层析（略） 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量，